| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-28页 |
| ·Wnt信号通路 | 第14-15页 |
| ·经典wnt信号通路概述 | 第14-15页 |
| ·Wnt信号中的PYGO蛋白 | 第15-19页 |
| ·果蝇中和哺乳动物的Pygopus | 第16页 |
| ·Pygopus和癌症 | 第16-17页 |
| ·Pygopus蛋白的转录共激活功能 | 第17-19页 |
| ·Pygopus在转录调控中发挥功能的机制 | 第19页 |
| ·Pygopus蛋白研究现状 | 第19页 |
| ·酵母双杂交系统的基本原理及应用 | 第19-25页 |
| ·酵母双杂交系统的理论基础 | 第19-21页 |
| ·MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 3的作用原理 | 第21-24页 |
| ·酵母双杂交的应用 | 第24-25页 |
| ·酵母双杂交的局限性 | 第25页 |
| ·本课题的主要目的和技术路线 | 第25-28页 |
| 第二章 诱饵质粒pGBKT7-hpygopus2~(△NHD)的构建与鉴定 | 第28-43页 |
| ·实验材料 | 第28-33页 |
| ·菌种 | 第28页 |
| ·质粒 | 第28-29页 |
| ·培养基 | 第29-30页 |
| ·主要试剂 | 第30-32页 |
| ·主要仪器与设备 | 第32-33页 |
| ·实验方法 | 第33-36页 |
| ·PCR扩增hPygo2~(△NHD)蛋白 | 第33页 |
| ·PGBKT7-hpygopus2~(△NHD)重组质粒的构建 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌的转化 | 第34页 |
| ·酵母转化 | 第34-35页 |
| ·诱饵质粒在AH109中表达的鉴定 | 第35-36页 |
| ·结果 | 第36-42页 |
| ·hpygopus2~(△NHD)的PCR结果 | 第36页 |
| ·重组质粒pGBKT7-hpygopus2~(△NHD)的鉴定 | 第36-37页 |
| ·pGBKT7-hpygopus2~(△NHD)转入AH109 | 第37-40页 |
| ·诱饵质粒自激活测试结果 | 第40-41页 |
| ·诱饵质粒表达的检测 | 第41-42页 |
| ·讨论 | 第42-43页 |
| 第三章 人乳腺文库的筛选 | 第43-56页 |
| ·实验材料 | 第43-45页 |
| ·主要材料与试剂 | 第43-45页 |
| ·主要仪器与设备 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-50页 |
| ·人乳腺cDNA文库的滴度测定、扩增、质粒抽提和质量鉴定 | 第45-47页 |
| ·酵母宿主细胞AH109的表型验证 | 第47页 |
| ·cDNA文库的转化和营养缺陷筛选 | 第47-48页 |
| ·酵母质粒DNA的提取 | 第48页 |
| ·酵母质粒DNA转化大肠杆菌 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的小量快速抽提 | 第49页 |
| ·重转化排除假阳性 | 第49页 |
| ·DNA序列分析 | 第49-50页 |
| ·实验结果 | 第50-54页 |
| ·酵母细胞AH109的表型验证 | 第50页 |
| ·人乳腺cDNA文库的滴度测定及扩增 | 第50-51页 |
| ·文库的初步筛选 | 第51-53页 |
| ·再次共转化及重新确认结果 | 第53页 |
| ·测序结果及分析 | 第53-54页 |
| ·讨论 | 第54-56页 |
| 第四章 哺乳动物体内相互作用的检测 | 第56-67页 |
| ·实验材料 | 第56-58页 |
| ·菌株和细胞 | 第56页 |
| ·质粒 | 第56页 |
| ·培养基 | 第56页 |
| ·细胞培养所需试剂 | 第56-57页 |
| ·细胞转染所需试剂 | 第57页 |
| ·细胞裂解液 | 第57页 |
| ·抗体 | 第57页 |
| ·蛋白酶抑制剂 | 第57页 |
| ·荧光素酶LUC活性测定所需试剂 | 第57-58页 |
| ·实验方法 | 第58-62页 |
| ·构建p3×Flag-CMV-hpygopus~(△NHD) | 第58页 |
| ·构建pcDNA3.1-Myc-cdc73 | 第58页 |
| ·构建pCMV5-Myc-bc16 | 第58-59页 |
| ·质粒的扩增 | 第59-60页 |
| ·细胞培养与传代 | 第60页 |
| ·瞬时转染 | 第60页 |
| ·细胞裂解与蛋白收取 | 第60-61页 |
| ·免疫印迹分析 | 第61页 |
| ·荧光素酶LUC活性测定 | 第61-62页 |
| ·结果 | 第62-66页 |
| ·重组质粒进行限制性酶切鉴定 | 第62页 |
| ·重组质粒进行测序鉴定 | 第62页 |
| ·重组质粒的表达检测 | 第62-64页 |
| ·哺乳动物体内相互作用 | 第64-65页 |
| ·荧光素酶活性测定 | 第65-66页 |
| ·讨论 | 第66-67页 |
| 结论与展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 附录 | 第72-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
