| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-44页 |
| ·脂肪酶的研究概况 | 第13-26页 |
| ·脂肪酶简介 | 第13页 |
| ·脂肪酶的分类 | 第13-15页 |
| ·脂肪酶的理化性质 | 第15-16页 |
| ·脂肪酶的生产 | 第16-17页 |
| ·脂肪酶的催化机制 | 第17-18页 |
| ·脂肪酶的应用 | 第18-23页 |
| ·脂肪酶的研究进展 | 第23-26页 |
| ·脂肪酶基因的异源表达 | 第26-34页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第26-28页 |
| ·酿酒酵母表达系统 | 第28-31页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第31-33页 |
| ·脂肪酶的异源表达策略 | 第33-34页 |
| ·脂肪酶的定向进化 | 第34-41页 |
| ·定向进化技术简介 | 第34-35页 |
| ·突变体库的构建 | 第35-38页 |
| ·突变体库的高通量筛选 | 第38-40页 |
| ·脂肪酶的定向进化 | 第40-41页 |
| ·本课题的研究内容和意义 | 第41-44页 |
| ·本课题的立题依据 | 第41-42页 |
| ·本课题的研究思路 | 第42-43页 |
| ·本课题的研究内容 | 第43页 |
| ·本课题的目标和意义 | 第43-44页 |
| 第二章 白地霉脂肪酶基因5’侧翼序列的克隆与分析 | 第44-57页 |
| ·引言 | 第44页 |
| ·实验材料 | 第44-45页 |
| ·菌株和质粒 | 第44页 |
| ·酶和生化试剂 | 第44页 |
| ·培养基和溶液 | 第44-45页 |
| ·仪器和设备 | 第45页 |
| ·实验方法 | 第45-52页 |
| ·接头PCR法扩增临近已知序列的未知旁侧序列 | 第45-46页 |
| ·白地霉的培养 | 第46页 |
| ·白地霉总DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·白地霉总DNA限制性片段文库的构建 | 第47页 |
| ·回收限制性酶切片段 | 第47-48页 |
| ·基因组步移文库的构建 | 第48页 |
| ·接头PCR法扩增lip42 的5’侧翼序列 | 第48-49页 |
| ·lip42 5’侧翼序列的TA克隆 | 第49-50页 |
| ·lip42 5’侧翼序列的序列测定 | 第50页 |
| ·高保真酶扩增lip42 5’侧翼序列 | 第50-52页 |
| ·结果与分析 | 第52-56页 |
| ·白地霉总DNA的提取 | 第52页 |
| ·白地霉总DNA限制性片段文库的构建 | 第52-53页 |
| ·第一轮接头PCR扩增lip42 的5’侧翼序列 | 第53-54页 |
| ·第二轮接头PCR扩增lip42 的5’侧翼序列 | 第54页 |
| ·lip42 的5’侧翼序列的序列测定 | 第54-55页 |
| ·高保真酶扩增lip42 的5’侧翼序列 | 第55页 |
| ·白地霉脂肪酶基因启动区的生物信息学分析 | 第55-56页 |
| ·讨论 | 第56-57页 |
| 第三章 白地霉脂肪酶基因在大肠杆菌中的异源表达 | 第57-68页 |
| ·引言 | 第57页 |
| ·实验材料 | 第57-58页 |
| ·菌株与质粒 | 第57页 |
| ·酶和试剂 | 第57页 |
| ·培养基和溶液 | 第57-58页 |
| ·仪器和设备 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-63页 |
| ·重组表达载体pET26-lip42 的构建 | 第58-61页 |
| ·重组表达载体转化表达菌株BL21（DE3） | 第61页 |
| ·功能平板检测重组大肠杆菌的脂肪酶活性 | 第61-62页 |
| ·重组大肠杆菌的诱导表达 | 第62页 |
| ·SDS-PAGE检测重组脂肪酶的表达情况 | 第62-63页 |
| ·结果与分析 | 第63-67页 |
| ·重组表达载体pET26-lip42 的构建 | 第63-65页 |
| ·功能平板检测重组大肠杆菌的脂肪酶活性 | 第65-66页 |
| ·SDS-PAGE检测重组脂肪酶的表达情况 | 第66-67页 |
| ·讨论 | 第67-68页 |
| 第四章 产脂肪酶的酵母筛选培养基的改良 | 第68-75页 |
| ·引言 | 第68页 |
| ·实验材料 | 第68-70页 |
| ·菌株与酶液 | 第68页 |
| ·试剂 | 第68-69页 |
| ·培养基 | 第69页 |
| ·仪器设备 | 第69-70页 |
| ·实验方法 | 第70页 |
| ·酵母单菌落的制备 | 第70页 |
| ·重组酿酒酵母脂肪酶的诱导表达 | 第70页 |
| ·重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达 | 第70页 |
| ·结果与分析 | 第70-74页 |
| ·重组酿酒酵母的诱导表达 | 第70-72页 |
| ·重组毕赤酵母的诱导表达 | 第72-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| 第五章 白地霉脂肪酶基因在酿酒酵母中的异源表达 | 第75-88页 |
| ·引言 | 第75页 |
| ·实验材料 | 第75-76页 |
| ·菌株与质粒 | 第75页 |
| ·酶和试剂 | 第75页 |
| ·培养基和溶液 | 第75-76页 |
| ·仪器和设备 | 第76页 |
| ·实验方法 | 第76-82页 |
| ·重组表达载体pHBM354-lip42 的构建 | 第76-78页 |
| ·原始载体与重组载体转化酿酒酵母INVScⅠ | 第78-79页 |
| ·功能平板筛选有脂肪酶活性的重组酿酒酵母 | 第79页 |
| ·重组酿酒酵母的诱导表达 | 第79-80页 |
| ·脂肪酶酶液的制备 | 第80-81页 |
| ·Bradford法测定脂肪酶酶液的浓度 | 第81-82页 |
| ·碱滴定法测定脂肪酶的活性 | 第82页 |
| ·结果与分析 | 第82-86页 |
| ·重组表达载体pHBM354-lip42 的构建 | 第82-84页 |
| ·原始载体与重组载体转化酿酒酵母INVScⅠ | 第84页 |
| ·功能平板筛选重组酿酒酵母 | 第84-85页 |
| ·重组酿酒酵母的诱导表达与脂肪酶酶液的活性检测 | 第85-86页 |
| ·Bradford法测定脂肪酶酶液的浓度 | 第86页 |
| ·碱滴定法测定脂肪酶的活性 | 第86页 |
| ·脂肪酶酶液的比活力 | 第86页 |
| ·讨论 | 第86-88页 |
| 第六章 白地霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的展示表达 | 第88-102页 |
| ·引言 | 第88页 |
| ·实验材料 | 第88-89页 |
| ·菌株与质粒 | 第88页 |
| ·酶和试剂 | 第88页 |
| ·培养基和溶液 | 第88-89页 |
| ·仪器和设备 | 第89页 |
| ·实验方法 | 第89-96页 |
| ·重组展示表达载体pAMB121-lip42 的构建 | 第89-90页 |
| ·重组展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42 的构建 | 第90-95页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第95-96页 |
| ·产脂肪酶的重组酵母的筛选 | 第96页 |
| ·重组毕赤酵母脂肪酶的诱导表达 | 第96页 |
| ·重组毕赤酵母脂肪酶活性的测定 | 第96页 |
| ·结果与分析 | 第96-100页 |
| ·重组展示表达载体pAMB121-lip42 的构建 | 第96-97页 |
| ·重组展示表达载体pPIC9K-Flo1-lip42 的构建 | 第97-99页 |
| ·毕赤酵母的转化 | 第99页 |
| ·产脂肪酶的重组酵母的筛选 | 第99-100页 |
| ·重组毕赤酵母脂肪酶活性的测定 | 第100页 |
| ·讨论 | 第100-102页 |
| 第七章 白地霉脂肪酶的定向进化 | 第102-118页 |
| ·引言 | 第102页 |
| ·实验材料 | 第102-103页 |
| ·菌株与质粒 | 第102页 |
| ·酶和试剂 | 第102页 |
| ·培养基和溶液 | 第102-103页 |
| ·仪器和设备 | 第103页 |
| ·实验方法 | 第103-108页 |
| ·突变脂肪酶基因eplip42 的扩增 | 第103-104页 |
| ·载体pHBM354-lip42 和pHBM354 的大量制备 | 第104-105页 |
| ·原始载体pHBM354 的双酶切 | 第105页 |
| ·eplip42 片段和pHBM354 线性片段的共转化 | 第105-106页 |
| ·功能平板SC-TBT大量筛选突变脂肪酶 | 第106页 |
| ·突变脂肪酶的诱导表达 | 第106页 |
| ·突变脂肪酶酶液的制备 | 第106页 |
| ·突变脂肪酶酶液中蛋白含量的测定 | 第106页 |
| ·碱滴定法测定突变脂肪酶的活性 | 第106页 |
| ·突变脂肪酶的生物信息学分析 | 第106-108页 |
| ·结果与分析 | 第108-114页 |
| ·突变脂肪酶基因eplip42 的扩增 | 第108页 |
| ·载体pHBM354-lip42 和pHBM354 的大量制备 | 第108-109页 |
| ·原始载体pHBM354 的双酶切 | 第109页 |
| ·eplip42 和pHBM354 共转化酿酒酵母INVScⅠ | 第109页 |
| ·功能平板SC-TBT大量筛选突变脂肪酶 | 第109-112页 |
| ·突变脂肪酶酶液中蛋白含量及脂肪酶比活力的测定 | 第112页 |
| ·突变脂肪酶的生物信息学分析 | 第112-114页 |
| ·讨论 | 第114-118页 |
| ·易错PCR中突变的偏好性问题 | 第114页 |
| ·易错PCR中突变率的控制 | 第114-115页 |
| ·酵母体内重组法构建脂肪酶突变体库 | 第115-116页 |
| ·脂肪酶定向进化中筛选方法的改进 | 第116页 |
| ·突变脂肪酶基因扩增过程中的若干问题 | 第116-117页 |
| ·突变子的质粒丢失问题 | 第117页 |
| ·脂肪酶基因的突变与回复突变 | 第117-118页 |
| 第八章 全文结论 | 第118-120页 |
| 参考文献 | 第120-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 作者简历 | 第128页 |
