| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略词 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-19页 |
| 1.1 尼古丁的性质和危害 | 第12-13页 |
| 1.2 微生物降解尼古丁代谢途径的研究进展 | 第13-15页 |
| 1.3 6-羟基-尼古丁氧化酶 | 第15-16页 |
| 1.4 2, 5-二羟基吡啶双加氧酶 | 第16-17页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第17-19页 |
| 第二章 agnB和agnE的克隆及其编码氨基酸序列的分析 | 第19-33页 |
| 2.1 引言 | 第19页 |
| 2.2 材料与方法 | 第19-21页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第19页 |
| 2.2.2 培养基和溶液 | 第19页 |
| 2.2.3 仪器 | 第19页 |
| 2.2.4 agnB和agnE的PCR扩增 | 第19-20页 |
| 2.2.5 DNA片段的纯化 | 第20-21页 |
| 2.2.6 agnB和agnE编码氨基酸序列分析 | 第21页 |
| 2.3 结果与分析 | 第21-32页 |
| 2.3.1 agnB和agnE的克隆 | 第21-23页 |
| 2.3.2 AgnB和AgnE氨基酸序列分析 | 第23-24页 |
| 2.3.3 AgnB和AgnE的系统进化树构建 | 第24-26页 |
| 2.3.4 AgnB和AgnE保守序列分析和保守结构域预测 | 第26-30页 |
| 2.3.5 AgnB和AgnE二级结构分析和三维结构建模 | 第30-32页 |
| 2.4 小结 | 第32-33页 |
| 第三章 agnB和agnE在大肠杆菌中的表达 | 第33-47页 |
| 3.1 引言 | 第33页 |
| 3.2 材料与方法 | 第33-38页 |
| 3.2.1 菌株 | 第33页 |
| 3.2.2 培养基和溶液 | 第33-34页 |
| 3.2.3 仪器 | 第34-35页 |
| 3.2.4 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第35页 |
| 3.2.5 DNA片段的酶切与纯化 | 第35-36页 |
| 3.2.6 DNA片段的连接 | 第36页 |
| 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第36页 |
| 3.2.8 重组质粒转化E. coli BL21(DE3) | 第36-37页 |
| 3.2.9 阳性克隆筛选和重组质粒的验证 | 第37页 |
| 3.2.10 IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对目的蛋白表达量的影响 | 第37页 |
| 3.2.11 粗酶液的制备和蛋白的纯化 | 第37页 |
| 3.2.12 SDS-PAGE电泳分析 | 第37-38页 |
| 3.3 结果与分析 | 第38-45页 |
| 3.3.1 重组质粒的构建 | 第38-41页 |
| 3.3.1.1 重组质粒p ET28a(+)-agnB的构建与验证 | 第38-39页 |
| 3.3.1.2 重组质粒p ET28a(+)-agnE的构建与验证 | 第39-41页 |
| 3.3.2 IPTG浓度对AgnB和AgnE表达的影响 | 第41-42页 |
| 3.3.3 诱导温度对AgnB和AgnE表达的影响 | 第42-43页 |
| 3.3.4 诱导时间对AgnB和AgnE表达的影响 | 第43-44页 |
| 3.3.5 AgnB和AgnE的可溶性分析 | 第44-45页 |
| 3.4 小结 | 第45-47页 |
| 第四章 AgnE功能分析 | 第47-54页 |
| 4.1 引言 | 第47页 |
| 4.2 材料与方法 | 第47-48页 |
| 4.2.1 培养基和溶液 | 第47页 |
| 4.2.2 仪器 | 第47页 |
| 4.2.3 AgnE蛋白的功能分析 | 第47页 |
| 4.2.4 温度对AgnE生物活性影响的测定 | 第47页 |
| 4.2.5 pH对AgnE生物活性影响的测定 | 第47-48页 |
| 4.2.6 金属离子对AgnE生物活性影响的测定 | 第48页 |
| 4.2.7 AgnE的突变 | 第48页 |
| 4.2.8 AgnE突变体生物活性测定 | 第48页 |
| 4.3 结果与分析 | 第48-52页 |
| 4.3.1 AgnE生物活性的检测 | 第48-49页 |
| 4.3.2 温度对AgnE生物活性的影响 | 第49-50页 |
| 4.3.3 pH对AgnE生物活性的影响 | 第50页 |
| 4.3.4 金属离子对AgnE生物活性的影响 | 第50-51页 |
| 4.3.5 AgnE突变体的生物活性分析 | 第51-52页 |
| 4.4 小结 | 第52-54页 |
| 第五章 总结与展望 | 第54-56页 |
| 5.1 总结 | 第54-55页 |
| 5.2 展望 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-65页 |
| 致谢 | 第65-66页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文 | 第66页 |
