| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 CRISPR/Cas 系统概述 | 第12-18页 |
| 一、CRISPR/CAS系统的历史 | 第12-13页 |
| 二、CRISPR/CAS系统的结构 | 第13页 |
| 三、CRISPR/CAS系统的类型 | 第13-14页 |
| 四、CRISPR/CAS系统的免疫作用机制 | 第14-15页 |
| 五、CRISPR/CAS9系统的特点 | 第15页 |
| 六、CRISPR/CAS9技术的应用 | 第15-17页 |
| 七、CRISPR/CAS9技术目前存在的问题 | 第17页 |
| 八、CRISPR/CAS9技术的展望 | 第17-18页 |
| 第二章 CRISPR/CAS9技术介导绒山羊VEGF基因定点整合的研究 | 第18-63页 |
| 1 引言 | 第18-21页 |
| 1.1 CRISPR/CAS9介导VEGF基因在CCR5位点定点敲入载体的构建 | 第18-19页 |
| 1.2 CRISPR/CAS9介导VEGF基因打靶细胞系的筛选及鉴定 | 第19页 |
| 1.3 定点敲入VEGF基因的绒山羊制备与检测 | 第19-21页 |
| 2 材料和方法 | 第21-43页 |
| 2.1 材料 | 第21-25页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第21页 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 | 第21-24页 |
| 2.1.3 实验材料 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-43页 |
| 2.2.1 绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定 | 第25-30页 |
| 2.2.2 VEGF外源基因整合载体P1-KV-polyA-P2的构建 | 第30-32页 |
| 2.2.3 绒山羊胎儿成纤维细胞分离及培养 | 第32页 |
| 2.2.4 绒山羊胎儿成纤维细胞的解冻及复苏 | 第32页 |
| 2.2.5 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.6 VEGF打靶载体P1-KV-polyA-P2转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第33-34页 |
| 2.2.7 VEGF基因定点敲入阳性细胞的筛选 | 第34页 |
| 2.2.8 VEGF基因打靶阳性细胞的鉴定 | 第34-35页 |
| 2.2.9 体细胞核移植技术制备重构胚胎 | 第35-36页 |
| 2.2.10 原核注射技术制备克隆胚胎 | 第36-37页 |
| 2.2.11 移植及产羔 | 第37-38页 |
| 2.2.12 定点整合VEGF基因绒山羊的鉴定 | 第38-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-59页 |
| 3.1 绒山羊胎儿成纤维细胞电转染法转染条件的确定 | 第43页 |
| 3.2 gRNA表达载体设计和构建 | 第43-46页 |
| 3.2.1 gRNA的设计 | 第43-44页 |
| 3.2.2 gRNA表达载体的构建 | 第44-45页 |
| 3.2.3 CRISPR/Cas9表达载体的质量检测 | 第45-46页 |
| 3.2.4 Surveyor突变检测试剂盒检测结果 | 第46页 |
| 3.3 VEGF外源基因敲入载体P1-KV-polyA-P2 | 第46-50页 |
| 3.3.1 上游同源臂(P1)下游同源臂(P2)及polyA序列的克隆 | 第46-47页 |
| 3.3.2 打靶载体P1-KV-polyA-P2的构建 | 第47-49页 |
| 3.3.3 打靶载体P1-KV-polyA-P2鉴定 | 第49-50页 |
| 3.4 阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞的分离与培养 | 第50-51页 |
| 3.5 绒山羊胎儿成纤维细胞的性别鉴定 | 第51页 |
| 3.6 VEGF打靶载体P1-KV-polyA-P2转染绒山羊胎儿成纤维细胞 | 第51-52页 |
| 3.7 VEGF基因打靶阳性细胞的鉴定 | 第52-53页 |
| 3.8 卵母细胞体外成熟及发育 | 第53-55页 |
| 3.9 重构胚胎移植及产羔 | 第55-56页 |
| 3.10 定点整合VEGF基因绒山羊的鉴定 | 第56-59页 |
| 3.10.1 新生羊PCR扩增检测 | 第56-57页 |
| 3.10.2 新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因的mRNA表达情况 | 第57-58页 |
| 3.10.3 新生绒山羊皮肤组织中VEGF基因蛋白水平表达情况 | 第58-59页 |
| 4 讨论 | 第59-63页 |
| 4.1 CRISPR/CAS9介导VEGF基因在CCR5位点定点敲入载体的构建 | 第59-60页 |
| 4.2 CRISPR/CAS9介导VEGF基因打靶细胞系的筛选及鉴定 | 第60页 |
| 4.3 定点敲入VEGF基因的绒山羊制备与检测 | 第60-63页 |
| 参考文献 | 第63-76页 |
| 结论 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77-78页 |
| 攻读学位期间已发表学术论文 | 第78页 |
