| 缩略语表 | 第8-12页 |
| 中文摘要 | 第12-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 前言 | 第21-22页 |
| 文献回顾 | 第22-36页 |
| 一、MIRNA与WNT通路在结肠癌中的研究现状 | 第22-31页 |
| 1 miRNA的生物学特性 | 第22-24页 |
| 2 miRNA在结肠癌分子调控网络中的研究现状 | 第24-27页 |
| 3 Wnt通路及与其相互调控的miRNA在结肠癌中的研究现状 | 第27-31页 |
| 二、表观遗传学调控在结肠癌中的研究现状 | 第31-36页 |
| 1 与DNA甲基化相关的修饰调控 | 第31-33页 |
| 2 与组蛋白相关的修饰调控 | 第33-36页 |
| 第一部分 结肠癌细胞中受WNT信号调控miRNA的筛选及鉴定 | 第36-58页 |
| 1 材料 | 第36-39页 |
| 1.1 细胞株 | 第36页 |
| 1.2 主要试剂 | 第36-37页 |
| 1.3 主要仪器 | 第37页 |
| 1.4 小干扰RNA、质粒及引物序列 | 第37-39页 |
| 2 方法 | 第39-45页 |
| 2.1 细胞培养 | 第39-40页 |
| 2.2 细胞转染 | 第40-41页 |
| 2.3 细胞RNA的提取、反转录及实时定量PCR检测(qRT-PCR) | 第41-42页 |
| 2.4 染色质免疫沉淀反应及qPCR检测(ChIP-qPCR) | 第42-44页 |
| 2.5 ChIP-seq数据库分析 | 第44页 |
| 2.6 数据分析与统计 | 第44-45页 |
| 3 结果 | 第45-55页 |
| 3.1 结肠癌细胞中受Wnt信号调控的miRNA筛选 | 第45-52页 |
| 3.2 结肠癌细胞中受Wnt信号调控的miRNA验证 | 第52-53页 |
| 3.3 MiR-145受Wnt信号负调控的细胞系验证 | 第53页 |
| 3.4 miR-145启动子区中TCF4结合位点的发现及鉴定 | 第53-54页 |
| 3.5 TCF4-β-catenin复合物在miR-145启动子区中TCF4结合位点富集的验证 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| 第二部分 miR-145抑制结肠癌的侵袭和转移 | 第58-70页 |
| 1 材料 | 第58-60页 |
| 1.1 细胞株 | 第58页 |
| 1.2 主要试剂 | 第58-59页 |
| 1.3 主要仪器 | 第59页 |
| 1.4 小干扰RNA、质粒及引物序列 | 第59-60页 |
| 1.5 结肠癌临床标本 | 第60页 |
| 1.6 实验动物 | 第60页 |
| 2 方法 | 第60-64页 |
| 2.1 细胞培养 | 第60页 |
| 2.2 细胞转染及病毒感染建系 | 第60-61页 |
| 2.3 细胞和蜡块RNA的提取、反转录及实时定量PCR检测(qRT-PCR) | 第61页 |
| 2.4 划痕迁移实验 | 第61页 |
| 2.5 Transwell侵袭实验 | 第61-62页 |
| 2.6 细胞蛋白提取、定量及蛋白质印记检测(Western Blot) | 第62-63页 |
| 2.7 裸鼠结肠癌肝、肺转移模型的建立 | 第63-64页 |
| 2.8 数据分析与统计 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-68页 |
| 3.1 miR-145在结肠癌原发肿瘤和转移肿瘤中表达水平的检测 | 第64-65页 |
| 3.2 检测miR-145在体外对结肠癌细胞侵袭和转移能力的影响 | 第65-66页 |
| 3.3 检测miR-145在体外对结肠癌细胞EMT表型的影响 | 第66-68页 |
| 3.4 检测miR-145在体内对结肠癌细胞侵袭和转移能力的影响 | 第68页 |
| 4 讨论 | 第68-70页 |
| 第三部分 miR-145通过靶向LASP1抑制结肠癌细胞侵袭和转移 | 第70-80页 |
| 1 材料 | 第70-72页 |
| 1.1 细胞株 | 第70页 |
| 1.2 主要试剂 | 第70页 |
| 1.3 主要仪器 | 第70-71页 |
| 1.4 主要引物及序列合成 | 第71-72页 |
| 1.5 结肠癌临床标本 | 第72页 |
| 1.6 实验动物 | 第72页 |
| 2 方法 | 第72-74页 |
| 2.1 细胞培养 | 第72页 |
| 2.2 细胞转染及病毒感染建系 | 第72页 |
| 2.3 荧光素酶报告基因 | 第72-73页 |
| 2.4 细胞蛋白提取、定量及蛋白质印记检测(Western Blot) | 第73页 |
| 2.5 LASP1过表达质粒PCDH-LASP1的构建 | 第73页 |
| 2.6 划痕迁移实验 | 第73页 |
| 2.7 Transwell侵袭实验 | 第73页 |
| 2.8 裸鼠结肠癌肝、肺转移模型的建立 | 第73页 |
| 2.9 免疫组织化学染色(IHC) | 第73-74页 |
| 2.10 蜡块RNA的提取、反转录及实时定量PCR检测(qRT-PCR) | 第74页 |
| 2.11 数据分析与统计 | 第74页 |
| 3 结果 | 第74-78页 |
| 3.1 LASP1作为miR-145靶基因的验证 | 第74-76页 |
| 3.2 LASP1参与miR-145抑制结肠癌细胞侵袭转移的回复验证 | 第76-77页 |
| 3.3 miR-145靶向沉默LASP1在转移模型及临床标本中的验证 | 第77-78页 |
| 4 讨论 | 第78-80页 |
| 第四部分 WNT信号通过募集PRC2复合物抑制MIR-145的表达 | 第80-91页 |
| 1 材料 | 第80-82页 |
| 1.1 细胞株 | 第80页 |
| 1.2 主要试剂 | 第80-81页 |
| 1.3 主要仪器 | 第81页 |
| 1.4 小干扰RNA、质粒及引物序列 | 第81-82页 |
| 2 方法 | 第82-83页 |
| 2.1 细胞培养 | 第82页 |
| 2.2 细胞转染及药物处理 | 第82页 |
| 2.3 染色质免疫沉淀反应/染色质免疫沉淀复反应及qPCR检测(ChIP-qPCR/Re-ChIP) | 第82页 |
| 2.4 细胞RNA的提取、反转录及qPCR检测(qRT-PCR) | 第82页 |
| 2.5 细胞蛋白提取、定量及蛋白质印记检测(Western Blot) | 第82页 |
| 2.6 蛋白质免疫沉淀检测(Co-IP) | 第82-83页 |
| 2.7 数据分析与统计 | 第83页 |
| 3 结果 | 第83-89页 |
| 3.1 miR-145启动子区H3K27me3及PRC2复合物组分富集程度的检测 | 第83-85页 |
| 3.2 PRC2复合物介导的组蛋白H3K27三甲基化参与Wnt信号对miR-145负调控的验证 | 第85-86页 |
| 3.3 TCF4-β-catenin复合物可直接募集PRC2复合物实现对的miR-145表达负调控的验证 | 第86-88页 |
| 3.4 Wnt信号与组蛋白甲基化修饰共同负调控其他抑癌性miRNA的验证 | 第88-89页 |
| 4 讨论 | 第89-91页 |
| 第五部分 MIR-145反向抑制WNT信号及组蛋白甲基化酶复合物 | 第91-104页 |
| 1 材料 | 第91-93页 |
| 1.1 细胞株 | 第91页 |
| 1.2 主要试剂 | 第91页 |
| 1.3 主要仪器 | 第91-92页 |
| 1.4 小干扰RNA、质粒及引物序列 | 第92页 |
| 1.5 结肠癌临床标本 | 第92页 |
| 1.6 实验动物 | 第92-93页 |
| 2 方法 | 第93-95页 |
| 2.1 细胞培养 | 第93页 |
| 2.2 细胞转染及病毒感染建系 | 第93页 |
| 2.3 荧光素酶报告基因 | 第93-94页 |
| 2.4 细胞、组织和蜡块RNA的提取、反转录及实时定量PCR检测(qRT-PCR) | 第94页 |
| 2.5 染色质免疫沉淀反应及qPCR检测(ChIP-qPCR) | 第94页 |
| 2.6 细胞蛋白提取、定量及蛋白质印记检测(Western Blot) | 第94页 |
| 2.7 裸鼠肿瘤生长模型的建立 | 第94-95页 |
| 2.8 免疫组织化学染色(IHC) | 第95页 |
| 2.9 数据分析与统计 | 第95页 |
| 3 结果 | 第95-102页 |
| 3.1 miR-145对Wnt通路及PRC2复合物抑制作用的发现 | 第95-97页 |
| 3.2 miR-145靶向抑制TCF4及SUZ12的发现及验证 | 第97-99页 |
| 3.3 miR-145靶向抑制TCF4及SUZ12在裸鼠成瘤模型中的验证 | 第99-100页 |
| 3.4 miR-145与其负调因子/靶分子组成的双负反馈环路在结肠癌临床标本中的验证 | 第100-102页 |
| 4 讨论 | 第102-104页 |
| 小结 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-115页 |
| 个人简历和研究成果 | 第115-117页 |
| 致谢 | 第117-118页 |
