| 致谢 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-14页 |
| 1. 文献综述 | 第14-29页 |
| ·酯酶 | 第14-16页 |
| ·酯酶的分类和来源 | 第14页 |
| ·酯酶的立体结构和催化机制 | 第14-16页 |
| ·酯酶的工业应用 | 第16页 |
| ·酶的立体选择性在手性药物合成中的重要性 | 第16-18页 |
| ·手性药物的研究意义 | 第16-17页 |
| ·手性药物的生物活性差异 | 第17页 |
| ·酶催化消旋体拆分合成手性化合物 | 第17-18页 |
| ·酶的定向进化研究 | 第18-29页 |
| ·酶的定向进化的内涵 | 第18-19页 |
| ·定向进化的原理与目的 | 第19页 |
| ·酶定向进化的关键问题 | 第19-20页 |
| ·酶定向进化中突变文库的建立 | 第20-25页 |
| ·非重组方法构建突变库 | 第20-21页 |
| ·重组方法构建突变库 | 第21-25页 |
| ·酶定向进化中表达系统的选择 | 第25-26页 |
| ·定向进化工程中高通量筛选模型的建立 | 第26-27页 |
| ·蛋白质定向进化的研究进展 | 第27-28页 |
| ·计算机技术对于酶改造的辅助作用 | 第28页 |
| ·定向进化技术的展望 | 第28-29页 |
| 2. 酯酶的克隆与表达 | 第29-46页 |
| ·材料与方法 | 第29-38页 |
| ·材料 | 第29-30页 |
| ·菌株与质粒 | 第29页 |
| ·工具酶 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29-30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·实验方法 | 第30-38页 |
| ·模板基因组的提取 | 第30-31页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第31-32页 |
| ·质粒pET-30a(+)的提取与纯化 | 第32页 |
| ·酯酶基因的选择与引物设计和合成 | 第32-33页 |
| ·酯酶基因的纯化、酶切以及与pET-30a(+)的连接 | 第33-34页 |
| ·大肠杆菌BL21感受态的制备以及转化 | 第34-35页 |
| ·重组子的鉴定 | 第35页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第35-36页 |
| ·SDS-PAGE蛋白电泳 | 第36-38页 |
| ·Bradford法测定蛋白浓度 | 第38页 |
| ·结果 | 第38-44页 |
| ·酯酶基因的扩增 | 第38-41页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第41-43页 |
| ·表达载体和宿主细胞的选择 | 第41-42页 |
| ·重组表达载体pET-30a(+)系列的构建思路 | 第42-43页 |
| ·重组表达载体PET30a(+)-xln的诱导表达 | 第43页 |
| ·重组蛋白酶的浓度测定 | 第43-44页 |
| ·讨论 | 第44-45页 |
| ·结论 | 第45-46页 |
| 3. 酯酶活性和立体选择性的筛选 | 第46-58页 |
| ·材料与方法 | 第46-51页 |
| ·材料 | 第46-47页 |
| ·菌株与酶 | 第46-47页 |
| ·主要实验设备 | 第47页 |
| ·实验方法 | 第47-51页 |
| ·酶溶液以及酶粉的获得 | 第48页 |
| ·酯酶活力的测定 | 第48-49页 |
| ·酯酶底物特异性的测定 | 第49页 |
| ·温度对酯酶酶活的影响 | 第49页 |
| ·反应pH值对酯酶酶活的影响 | 第49页 |
| ·酯酶立体选择性的高通量筛选方法 | 第49-50页 |
| ·酯酶立体选择性的复筛 | 第50页 |
| ·气相分析条件 | 第50-51页 |
| ·结果 | 第51-57页 |
| ·酯酶活性的筛选结果 | 第51-52页 |
| ·酯酶立体选择性的高通量筛选结果 | 第52-54页 |
| ·高通量筛选模型的建立 | 第52页 |
| ·酯酶立体选择性的筛选结果 | 第52-53页 |
| ·酯酶立体选择性的复筛和气相分析 | 第53-54页 |
| ·酯酶的底物特异性 | 第54-55页 |
| ·温度和PH对酯酶活力的影响 | 第55-57页 |
| ·讨论 | 第57页 |
| ·结论 | 第57-58页 |
| 4. 酯酶诱导表达条件的优化和蛋白纯化 | 第58-72页 |
| ·材料与方法 | 第59-62页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·菌株 | 第59页 |
| ·试剂 | 第59-60页 |
| ·主要设备 | 第60页 |
| ·实验方法 | 第60-62页 |
| ·菌株活化与培养 | 第60页 |
| ·菌体生物量的测定 | 第60页 |
| ·IPTG浓度对蛋白表达的影响研究 | 第60页 |
| ·诱导温度对蛋白表达的影响研究 | 第60-61页 |
| ·不同的菌体生长程度对蛋白表达的影响 | 第61页 |
| ·蛋白表达的测定 | 第61页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第61页 |
| ·蛋白质分离纯化 | 第61-62页 |
| ·结果 | 第62-70页 |
| ·IPTG浓度对目的蛋白表达的影响 | 第62-63页 |
| ·不同菌体生长阶段对目的蛋白表达的影响 | 第63-65页 |
| ·诱导温度对目的蛋白表达的影响 | 第65-66页 |
| ·酯酶XL15目标蛋白的分离与纯化 | 第66页 |
| ·对酯酶XL15进行结构上的对比与分析 | 第66-70页 |
| ·讨论 | 第70-71页 |
| ·结论 | 第71-72页 |
| 5. 通过定向进化提高酯酶立体选择性的研究 | 第72-84页 |
| ·材料与方法 | 第72-76页 |
| ·材料 | 第72-73页 |
| ·菌株和质粒 | 第72页 |
| ·工具酶 | 第72-73页 |
| ·试剂 | 第73页 |
| ·主要设备 | 第73页 |
| ·实验方法 | 第73-76页 |
| ·易错PCR与突变文库的构建 | 第73-74页 |
| ·RSP_2728酯酶突变体的诱导表达 | 第74页 |
| ·阳性克隆手性选择性的初筛 | 第74-75页 |
| ·阳性克隆手性选择性的复筛 | 第75页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第75页 |
| ·分析方法 | 第75-76页 |
| ·结果 | 第76-83页 |
| ·易错PCR条件的确定 | 第76-77页 |
| ·突变体文库的构建 | 第77页 |
| ·突变体的筛选与鉴定 | 第77-79页 |
| ·突变体的高通量筛选模型 | 第77-78页 |
| ·突变体初筛与复筛结果 | 第78-79页 |
| ·活性与立体选择性的进化过程 | 第79-80页 |
| ·活性与立体选择性的进化过程 | 第80-81页 |
| ·突变基因的序列分析 | 第81-83页 |
| ·讨论 | 第83页 |
| ·结论 | 第83-84页 |
| 6. 结论与展望 | 第84-87页 |
| ·结论 | 第84-85页 |
| ·展望 | 第85-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 附录 | 第92-94页 |