短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达
| 致谢 | 第1-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-25页 |
| ·引言 | 第12页 |
| ·γ-氨基丁酸 | 第12-17页 |
| ·γ-氨基丁酸(GABA)的结构与性质 | 第12-14页 |
| ·GABA的生理功能 | 第14-16页 |
| ·GABA的应用 | 第16-17页 |
| ·GABA的制备 | 第17页 |
| ·谷氨酸脱羧酶 | 第17-19页 |
| ·谷氨酸脱羧酶研究进展 | 第17-18页 |
| ·谷氨酸脱羧酶性质 | 第18-19页 |
| ·谷氨酸脱羧酶的克隆和表达 | 第19页 |
| ·PCR | 第19-22页 |
| ·PCR原理简介 | 第19-20页 |
| ·PCR引物设计原则 | 第20-22页 |
| ·大肠杆菌和pET表达系统 | 第22-23页 |
| ·质粒表达载体 | 第22-23页 |
| ·表达宿主菌 | 第23页 |
| ·论文思路及主要内容 | 第23-25页 |
| 第二章 短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆 | 第25-51页 |
| ·引言 | 第25页 |
| ·实验材料与仪器 | 第25-28页 |
| ·菌种与质粒 | 第25-26页 |
| ·工具酶与试剂盒 | 第26-27页 |
| ·化学试剂 | 第27页 |
| ·培养基及抗生素 | 第27页 |
| ·主要实验仪器 | 第27-28页 |
| ·实验方法 | 第28-34页 |
| ·细胞生长测定 | 第28页 |
| ·短乳杆菌基因组抽提 | 第28-29页 |
| ·PCR扩增及PCR产物纯化回收 | 第29-30页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第30页 |
| ·感受态细胞制备及质粒转化 | 第30-31页 |
| ·质粒抽提 | 第31页 |
| ·T-A克隆 | 第31-33页 |
| ·转化子的菌落PCR鉴定 | 第33页 |
| ·测序及引物合成 | 第33页 |
| ·菌种保藏 | 第33-34页 |
| ·结果与讨论 | 第34-49页 |
| ·短乳杆菌培养 | 第34页 |
| ·γ-氨基丁酸高产菌株的菌种鉴定 | 第34-39页 |
| ·克隆引物设计 | 第39-41页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第41-43页 |
| ·GAD基历T-A克隆 | 第43-45页 |
| ·GAD基因测序 | 第45-49页 |
| ·本章小结 | 第49-51页 |
| 第三章 重组谷氨酸脱羧酶的表达及表达条件优化 | 第51-79页 |
| ·引言 | 第51页 |
| ·实验材料与仪器 | 第51-53页 |
| ·菌种与质粒 | 第51-52页 |
| ·工具酶与试剂盒 | 第52页 |
| ·化学试剂 | 第52-53页 |
| ·培养基及抗生素 | 第53页 |
| ·主要实验仪器 | 第53页 |
| ·分析检测方法 | 第53-61页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第53-54页 |
| ·考马斯亮蓝法 | 第54-56页 |
| ·活性测定方法 | 第56页 |
| ·纸层析 | 第56-57页 |
| ·高效液相色谱法 | 第57-61页 |
| ·实验方法 | 第61-63页 |
| ·短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因亚克隆 | 第61-62页 |
| ·谷氨酸脱羧酶的重组表达 | 第62-63页 |
| ·培养条件优化 | 第63页 |
| ·表达条件优化 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-78页 |
| ·短乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因亚克隆 | 第63-67页 |
| ·重组谷氨酸脱羧酶的表达 | 第67-70页 |
| ·培养条件的优化 | 第70-73页 |
| ·细胞破碎方式影响 | 第73-74页 |
| ·诱导条件优化 | 第74-78页 |
| ·本章小结 | 第78-79页 |
| 第四章 重组谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究 | 第79-89页 |
| ·引言 | 第79页 |
| ·实验材料与仪器 | 第79-80页 |
| ·菌种与质粒 | 第79-80页 |
| ·实验材料 | 第80页 |
| ·培养基 | 第80页 |
| ·主要仪器 | 第80页 |
| ·实验方法 | 第80-81页 |
| ·粗酶液的制备 | 第80页 |
| ·Ni-NTA纯化 | 第80-81页 |
| ·分析检测方法 | 第81页 |
| ·催化性质考察 | 第81页 |
| ·结果与讨论 | 第81-88页 |
| ·Ni-NTA纯化 | 第81-82页 |
| ·温度对重组GAD活性的影响 | 第82-85页 |
| ·pH值对重组GAD活性的影响 | 第85-86页 |
| ·PLP对重组GAD的影响 | 第86-87页 |
| ·重组GAD动力学分析 | 第87-88页 |
| ·本章小结 | 第88-89页 |
| 第五章 结论与建议 | 第89-91页 |
| ·结论 | 第89-90页 |
| ·建议 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-94页 |
