| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 摘要 | 第13-16页 |
| ABBREVIATION | 第16-18页 |
| CHAPTER 1 | 第18-41页 |
| 1.1 INTRODUCTION | 第18-20页 |
| 1.2 REVIEW OF LITERATURE | 第20-41页 |
| 1.2.1 Cattle industry in China | 第20-22页 |
| 1.2.2 Importance of bovine viral diarrhea virus(BVDV)in China | 第22-23页 |
| 1.2.3 History of BVDV | 第23页 |
| 1.2.4 Classification | 第23-24页 |
| 1.2.5 BVDV genome and function of the genomic polyprotein | 第24-26页 |
| 1.2.6 Host range and transmission | 第26页 |
| 1.2.7 Parhogenesis and Clinical features of BVDV | 第26-29页 |
| 1.2.8 Economical importance | 第29页 |
| 1.2.9 Diagnosis | 第29-32页 |
| 1.2.10 BVDV immune response | 第32-33页 |
| 1.2.11 BVDV vaccines | 第33-34页 |
| 1.2.12 Live vector-based vaccine | 第34-37页 |
| 1.2.13 BVDV immunization | 第37-38页 |
| 1.2.14 Control and eradication | 第38-40页 |
| 1.2.15 Objectives of the study | 第40-41页 |
| CHAPTER 2. THE CONSTRUCTION OF RECOMBINANT LACTOBACILLUS CASEI EXPRESSING BVDV E2 PROTEIN AND ITS IMMUNE RESPONSE IN MICE | 第41-72页 |
| 2.2 INTRODUCTION | 第41-43页 |
| 2.3 MATERIALS AND METHODS | 第43-58页 |
| 2.3.1 Cells and virus | 第43页 |
| 2.3.2 Vectors and bacterial strains | 第43-44页 |
| 2.3.3 Experimental animals | 第44页 |
| 2.3.4 Instruments used | 第44页 |
| 2.3.5 Common reagent | 第44-45页 |
| 2.3.6 Reagents required for SDS-PAGE and Western-blot analysis | 第45页 |
| 2.3.7 Solutions and preparation required for protein purification | 第45-46页 |
| 2.3.8 ELISA test solution preparation required | 第46页 |
| 2.3.9 Cell culture medium preparation | 第46-47页 |
| 2.3.10 Intestinal lavage preparation solutions | 第47页 |
| 2.3.11 Primer and probe | 第47页 |
| 2.3.12 Propagation of BVDV | 第47-48页 |
| 2.3.13 RNA extraction and cDNA preparation | 第48页 |
| 2.3.14 BVDV E2 gene amplification | 第48页 |
| 2.3.15 Purification of the amplified E2 gene | 第48-49页 |
| 2.3.16 Digestion of pELX1 vector | 第49-50页 |
| 2.3.17 Digestion of E2 gene | 第50页 |
| 2.3.18 Ligation of purified E2 gene with pELX1vector | 第50页 |
| 2.3.19 Preparation of DH5α competent cells | 第50-51页 |
| 2.3.20 Transformation of ligated products | 第51页 |
| 2.3.21 Extraction of recombinant plasmid and sequence analysis | 第51页 |
| 2.3.22 Identification of recombinant plasmid pELX1-E2 by digestion | 第51页 |
| 2.3.23 Transformation of recombinant plasmid pELX1-E2 | 第51页 |
| 2.3.24 Protein expression and analysis | 第51-53页 |
| 2.3.25 Electroporation into L. casei competent cells | 第53页 |
| 2.3.26 RT-PCR and sequence analysis of recombinant strain L.casei/pELX1-E2 | 第53-54页 |
| 2.3.27 E2 protein expression and cellular localization of recombinant L.casei | 第54页 |
| 2.3.28 In vivo evaluation of the recombinant L. casei/pELX1-E2 | 第54-56页 |
| 2.3.29 Protein purification for ELISA development | 第56页 |
| 2.3.30 ELISA for IgG and IgA | 第56-57页 |
| 2.3.31 Challenge experiment | 第57页 |
| 2.3.32 Viral load quantitation | 第57-58页 |
| 2.3.33 Serum neutralization assay | 第58页 |
| 2.3.34 Statistical Analysis | 第58页 |
| 2.4 RESULTS | 第58-67页 |
| 2.4.1 Amplification of BVDV E2 gene and Identification of the recombinant vectorp ELX1-E2 | 第58-60页 |
| 2.4.2 Expression and localization of E2 from recombinant L.casei/pELX1-E2 | 第60-62页 |
| 2.4.3 Humoral immune responses in mice immunized with recombinant L. casei/pELX1-E2 | 第62-64页 |
| 2.4.4 IFNγ and IL-12 detection | 第64-65页 |
| 2.4.5 Protection against BVDV challenge | 第65-66页 |
| 2.4.6 Neutralizing ability of BVDV infection in MDBK cell | 第66-67页 |
| 2.5 DISCUSSION | 第67-71页 |
| 2.5.1 The BVDV E2 protein is of potential immunological importance for novel vaceine development | 第67-68页 |
| 2.5.2 L.casei is a good vector for constructing new vaceine for eliciting mucosal immunity | 第68-69页 |
| 2.5.3 The roles of humoral and cell-mediated response on prevention of BVD | 第69-70页 |
| 2.5.4 The immune response can be affected by the immunization approaches | 第70-71页 |
| 2.6 CONCLUSION | 第71-72页 |
| CHAPTER 3. IN VITRO ANTIVIRAL ACTIVITY OF LACTOBACILLUS CASEI MCJ PROTEIN-BASED METABOLITES ON BOVE VIRAL DIARRHEA VIRUS | 第72-84页 |
| 3.2 INTRODUCTION | 第72-74页 |
| 3.3 MATERIALS AND METHODS | 第74-77页 |
| 3.3.1 Cells preparation and titration of virus | 第74页 |
| 3.3.2 Preparation of L.casei protein metabolites | 第74页 |
| 3.3.3 Cytotoxicity assay | 第74-75页 |
| 3.3.4 Plaque reduction assay | 第75页 |
| 3.3.5 Effect of LPM on viral infection | 第75-77页 |
| 3.4 RESULTS | 第77-81页 |
| 3.4.1 Toxic effects on cell | 第77-78页 |
| 3.4.2 LPM inhibits BVDV infectivity | 第78页 |
| 3.4.3 Inhibitory effects of LPM on E2 expression | 第78-79页 |
| 3.4.4 Anti-BVDV activity detection by indirect immunofluorescence antibody assay | 第79-80页 |
| 3.4.5 Inhibition on BVDV replication | 第80-81页 |
| 3.5 DISCUSSION | 第81-83页 |
| 3.6 CONCLUSION | 第83-84页 |
| CHAPTER 4. DEVELOPMENT OF MONOCLONAL AND POLYCLONAL ANTIBODY-BASED AC-ELISA FOR THE DETECTION OF BVDV-1 INFECTION | 第84-114页 |
| 4.2 INTRODUCTION | 第84-87页 |
| 4.3 MATERIALS AND METHODS | 第87-98页 |
| 4.3.1 Cells,viruses,bacteria,and plasmid | 第87页 |
| 4.3.2 Experimental animals | 第87-88页 |
| 4.3.3 Reagents | 第88页 |
| 4.3.4 Cloning,expression and purification of the recombinant E2 protein | 第88页 |
| 4.3.5 Cloning,expression and purification of the recombinant NS3 protein | 第88-89页 |
| 4.3.6 Anti-E2 monoclonal antibodies production | 第89-94页 |
| 4.3.7 Anti-NS3 polyclonal antibody productions | 第94页 |
| 4.3.8 Development of AC-ELISA | 第94-97页 |
| 4.3.9 Validation of AC-ELISA | 第97-98页 |
| 4.4 RESULTS | 第98-109页 |
| 4.4.1 Construction of recombinant NS3 plasmid | 第98-99页 |
| 4.4.2 Confirmation of NS3 protein expression | 第99-100页 |
| 4.4.3 Hybridoma selection and monoclonal antibody production | 第100页 |
| 4.4.4 Analysis of polyclonal antibodies | 第100-101页 |
| 4.4.5 Development of AC-ELISA for BVDV antigen detection | 第101-109页 |
| 4.5 DISCUSSION | 第109-113页 |
| 4.5.1 Comparison of AC-ELISA assay with other antigen detection assays | 第109页 |
| 4.5.2 Reasons of using both E2 Mab and NS3 Pab: | 第109-111页 |
| 4.5.3 Comparisons with other developed ELISA assays for BVDV | 第111页 |
| 4.5.4 Discussion about AC-ELISA validation evaluation | 第111-113页 |
| 4.6 CONCLUSION | 第113-114页 |
| CHAPTER 5. GENERAL CONCLUSION, INNOVATION, AND FUTURE DIRECTION OF THE STUDY | 第114-116页 |
| 5.1 GENERAL CONCLUSION | 第114-115页 |
| 5.2 INNOVATIONS OF THE STUDY | 第115页 |
| 5.3 FUTURE DIRECTION OF THE STUDY | 第115-116页 |
| REFERENCES | 第116-137页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第137-139页 |
| SCIENTIFIC CONTRIBUTION DURING PHD | 第139-141页 |
| ABOUT AUTHOR | 第141页 |
