| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 目录 | 第7-10页 |
| 第一章 引言 | 第10-19页 |
| 1.1 紫花苜蓿概况 | 第10-11页 |
| 1.1.1 紫花苜蓿是一种营养价值高的牧草 | 第10页 |
| 1.1.2 紫花苜蓿经济效益和生态功能 | 第10页 |
| 1.1.3 紫花苜蓿的基因工程研究现状 | 第10-11页 |
| 1.2 植物内参基因 | 第11-12页 |
| 1.2.1 植物qRT-PCR内参基因的选择 | 第11页 |
| 1.2.2 植物内参基因稳定性分析方法 | 第11-12页 |
| 1.3 植物转录因子 | 第12页 |
| 1.3.1 植物转录因子的功能 | 第12页 |
| 1.3.2 植物转录因子的研究方法 | 第12页 |
| 1.4 WRKY转录因子 | 第12-15页 |
| 1.4.1 WRKY结构域和W-box | 第13页 |
| 1.4.2 WRKY功能 | 第13-15页 |
| 1.4.3 苜蓿WRKY转录因子研究进展 | 第15页 |
| 1.5 高通量技术 | 第15-16页 |
| 1.5.1 高通量技术主要类型 | 第16页 |
| 1.5.2 高通量测序技术在植物上的应用 | 第16页 |
| 1.6 本课题研究的意义及技术路线 | 第16-19页 |
| 1.6.1 研究紫花苜蓿内参基因稳定性和转录因子WRKY33基因的目的意义 | 第16-17页 |
| 1.6.2 本课题研究的技术路线 | 第17-19页 |
| 第二章 紫花苜蓿内参基因的筛选 | 第19-35页 |
| 2.1 材料 | 第19页 |
| 2.1.1 植物材料和试剂 | 第19页 |
| 2.1.2 常用溶液及培养基 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 植物材料的处理 | 第19-20页 |
| 2.2.2 紫花苜蓿RNA提取 | 第20页 |
| 2.2.3 紫花苜蓿cDNA合成 | 第20-21页 |
| 2.2.4 18S rRNA基因克隆及序列分析 | 第21-24页 |
| 2.2.5 内参基因引物设计 | 第24页 |
| 2.2.6 内参基因引物检测 | 第24页 |
| 2.2.7 内参基因的荧光定量PCR分析 | 第24页 |
| 2.2.8 数据分析 | 第24-25页 |
| 2.3 结果与分析 | 第25-33页 |
| 2.3.1 紫花苜蓿提取RNA样品检测 | 第25页 |
| 2.3.2 18S rRNA基因克隆及序列分析 | 第25-27页 |
| 2.3.3 内参基因目的片段克隆 | 第27页 |
| 2.3.4 内参基因的荧光定量PCR分析 | 第27-28页 |
| 2.3.5 不同条件处理条件下内参基因的筛选 | 第28-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 紫花苜蓿WRKY33基因的克隆及分析 | 第35-45页 |
| 3.1 材料 | 第35页 |
| 3.1.1 植物材料和试剂 | 第35页 |
| 3.1.2 常用培养基及溶液 | 第35页 |
| 3.1.3 主要试剂盒 | 第35页 |
| 3.2 实验方法 | 第35-38页 |
| 3.2.1 植物材料处理方法 | 第35页 |
| 3.2.2 紫花苜蓿RNA提取 | 第35页 |
| 3.2.3 紫花苜蓿高通量测序 | 第35页 |
| 3.2.4 RACE法RNA模版准备 | 第35页 |
| 3.2.5 RACE技术路线与引物设计 | 第35-36页 |
| 3.2.6 制备RACE Ready cDNA | 第36-37页 |
| 3.2.7 紫花苜蓿WRKY基因5'-cDNA的克隆 | 第37-38页 |
| 3.2.8 紫花苜蓿WRKY基因3'-cDNA的克隆 | 第38页 |
| 3.2.9 紫花苜蓿WRKY33基因全长cDNA的克隆 | 第38页 |
| 3.2.10 MsWRKY33生物信息学分析 | 第38页 |
| 3.3 结果与分析 | 第38-43页 |
| 3.3.1 紫花苜蓿总RNA的检测 | 第38-39页 |
| 3.3.2 紫花苜蓿WRKY片段 | 第39页 |
| 3.3.3 紫花苜蓿WRKY基因5'末端和3'末端序列的克隆 | 第39-40页 |
| 3.3.4 紫花苜蓿WRKY基因全长的克隆 | 第40-41页 |
| 3.3.5 WRKY33基因的生物信息学分析 | 第41-43页 |
| 3.4 讨论 | 第43-45页 |
| 第四章 MSWRKY33表达分析及转化拟南芥初步检测 | 第45-55页 |
| 4.1 实验材料 | 第45页 |
| 4.1.1 植物材料 | 第45页 |
| 4.1.2 实验菌株和载体 | 第45页 |
| 4.1.3 实验中所用试剂盒与药品 | 第45页 |
| 4.1.4 主要溶液和培养基配制方法 | 第45页 |
| 4.2 实验方法 | 第45-50页 |
| 4.2.1 荧光定量PCR分析MsWRKY33表达模式 | 第45-47页 |
| 4.2.2 MsWRKY33表达载体构建 | 第47-48页 |
| 4.2.3 农杆菌介导的MsWRKY33遗传转化 | 第48-49页 |
| 4.2.4 转基因拟南芥植株的筛选 | 第49页 |
| 4.2.5 转基因拟南芥检测 | 第49-50页 |
| 4.2.6 拟南芥转基因功能分析 | 第50页 |
| 4.3 结果与分析 | 第50-53页 |
| 4.3.1 引物特异性检测 | 第50页 |
| 4.3.2 基因在不同逆境胁迫下的表达分析 | 第50-51页 |
| 4.3.3 转基因拟南芥的筛选 | 第51-52页 |
| 4.3.4 转基因拟南芥T_1代植株的PCR检测 | 第52页 |
| 4.3.5 转基因拟南芥T_2代植株的筛选 | 第52页 |
| 4.3.6 拟南芥转基因植株对低温处理的反应 | 第52-53页 |
| 4.4 讨论 | 第53-55页 |
| 第五章 结论 | 第55-57页 |
| 5.1 主要结论 | 第55-56页 |
| 5.2 本研究的主要创新点 | 第56页 |
| 5.3 本研究的存在不足和展望 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 附录 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
