| 学位论文数据集 | 第3-4页 |
| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 符号说明 | 第17-18页 |
| 第一章 文献综述 | 第18-54页 |
| 1.1 1,3-丙二醇概况 | 第18-20页 |
| 1.1.1 1,3-丙二醇的理化性质 | 第18页 |
| 1.1.2 1,3-丙二醇的用途 | 第18-19页 |
| 1.1.3 1,3-丙二醇的生产方法 | 第19-20页 |
| 1.2 微生物发酵生产1,3-丙二醇 | 第20-41页 |
| 1.2.1 产生1,3-丙二醇的微生物 | 第20-21页 |
| 1.2.2 1,3-丙二醇的代谢途径 | 第21-24页 |
| 1.2.3 1,3-丙二醇代谢中的关键酶及基因 | 第24-31页 |
| 1.2.3.1 甘油脱水酶(GDHt) | 第25-27页 |
| 1.2.3.2 甘油脱水酶再激活酶 | 第27-28页 |
| 1.2.3.3 1,3-PD氧化还原酶(PDOR) | 第28-30页 |
| 1.2.3.4 1,3-PD氧化还原酶的同功酶 | 第30页 |
| 1.2.3.5 甘油脱氢酶(GDH) | 第30页 |
| 1.2.3.6 二羟基丙酮激酶(DHAK) | 第30-31页 |
| 1.2.4 1,3-丙二醇的发酵过程的研究与开发 | 第31-37页 |
| 1.2.4.1 菌株选择 | 第31页 |
| 1.2.4.2 底物和产物耐受型菌株的筛选 | 第31-32页 |
| 1.2.4.3 发酵工艺的研究 | 第32-35页 |
| 1.2.4.4 产物和代谢中间产物对1,3-丙二醇发酵的影响 | 第35-36页 |
| 1.2.4.5 发酵过程的动力学研究 | 第36-37页 |
| 1.2.5 代谢网络工程的研究 | 第37-38页 |
| 1.2.5.1 1,3-丙二醇代谢网络分析 | 第37页 |
| 1.2.5.2 代谢网络调控 | 第37-38页 |
| 1.2.6 产1,3-丙二醇基因工程菌的研究 | 第38-41页 |
| 1.2.6.1 基因工程菌的构建策略 | 第38-39页 |
| 1.2.6.2 甘油转化1,3-丙二醇 | 第39页 |
| 1.2.6.3 葡萄糖转化1,3-丙二醇 | 第39-40页 |
| 1.2.6.4 副产物途径的敲除 | 第40-41页 |
| 1.2.7 1,3-丙二醇的分离纯化 | 第41页 |
| 1.3 存在的问题及展望 | 第41-42页 |
| 1.4 本课题的研究意义和立题依据 | 第42-44页 |
| 参考文献 | 第44-54页 |
| 第二章 1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 | 第54-78页 |
| 2.1 引言 | 第54页 |
| 2.2 材料和方法 | 第54-65页 |
| 2.2.1 菌株和质粒 | 第54-55页 |
| 2.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第55页 |
| 2.2.3 培养基 | 第55页 |
| 2.2.4 实验方法 | 第55-65页 |
| 2.2.4.1 克雷伯肺炎杆菌基因组DNA的提取 | 第55-56页 |
| 2.2.4.2 聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因dhaT | 第56-57页 |
| 2.2.4.3 琼脂糖凝胶电泳 | 第57-58页 |
| 2.2.4.4 从普通琼脂糖凝胶中回收DNA片段 | 第58页 |
| 2.2.4.5 目的基因与T载体的连接 | 第58页 |
| 2.2.4.6 重组DNA的电转化 | 第58-60页 |
| 2.2.4.7 阳性克隆的筛选 | 第60-61页 |
| 2.2.4.8 PCR产物的克隆和序列分析 | 第61-62页 |
| 2.2.4.9 重组表达质粒的构建 | 第62页 |
| 2.2.4.10 重组子的鉴定 | 第62-63页 |
| 2.2.4.11 大肠杆菌中诱导表达1,3-丙二醇氧化还原酶 | 第63-64页 |
| 2.2.4.12 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白浓度测定 | 第64页 |
| 2.2.4.13 超声波破碎细胞以及蛋白定位 | 第64-65页 |
| 2.2.4.14 亲和层析纯化1,3-丙二醇氧化还原酶 | 第65页 |
| 2.2.4.15 1,3-丙二醇氧化还原酶酶活测定 | 第65页 |
| 2.3 结果和讨论 | 第65-76页 |
| 2.3.1 克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae K4)基因组的提取 | 第65-66页 |
| 2.3.2 PCR扩增dhaTa和dhaTb | 第66-67页 |
| 2.3.3 T载体重组子的鉴定 | 第67-68页 |
| 2.3.4 dhaT基因的序列分析 | 第68页 |
| 2.3.5 重组表达载体的构建和鉴定 | 第68-70页 |
| 2.3.5.1 菌落PCR鉴定 | 第68-69页 |
| 2.3.5.2 酶切鉴定 | 第69-70页 |
| 2.3.6 重组1,3-丙二醇氧化还原酶的表达 | 第70-72页 |
| 2.3.6.1 重组大肠杆菌(pET-28a-dhaTa)胞内表达1,3-丙二醇氧化还原酶 | 第70-71页 |
| 2.3.6.2 重组大肠杆菌(pET-22b-dhaTb)胞间质分泌表达1,3-丙二醇氧化还原酶 | 第71-72页 |
| 2.3.7 重组1,3-丙二醇氧化还原酶的活性分析 | 第72-74页 |
| 2.3.8 重组1,3-丙二醇氧化还原酶的分离纯化及性质研究 | 第74-76页 |
| 2.3.8.1 Ni离子亲和层析纯化重组1,3-丙二醇氧化还原酶 | 第74页 |
| 2.3.8.2 pH值对重组1,3-丙二醇氧化还原酶的影响 | 第74-75页 |
| 2.3.8.3 温度对重组1,3-丙二醇氧化还原酶的影响 | 第75-76页 |
| 2.4 小结 | 第76页 |
| 参考文献 | 第76-78页 |
| 第三章 甘油脱水酶及其再激活因子基因的克隆、表达及再激活作用 | 第78-100页 |
| 3.1 引言 | 第78-79页 |
| 3.2 材料和方法 | 第79-86页 |
| 3.2.1 菌株和质粒 | 第79页 |
| 3.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第79页 |
| 3.2.3 培养基 | 第79页 |
| 3.2.4 实验方法 | 第79-86页 |
| 3.2.4.1 克雷伯肺炎杆菌基因组DNA的提取 | 第79页 |
| 3.2.4.2 dhaB基因的克隆及表达载体的构建 | 第79-81页 |
| 3.2.4.3 重组质粒的酶切鉴定 | 第81-82页 |
| 3.2.4.4 大肠杆菌中诱导表达甘油脱水酶 | 第82页 |
| 3.2.4.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白浓度测定 | 第82页 |
| 3.2.4.6 甘油脱水酶酶活测定 | 第82-83页 |
| 3.2.4.7 甘油脱水酶的纯化和序列测定 | 第83页 |
| 3.2.4.8 甘油脱水酶再激活因子基因gdrAB的克隆及表达载体的构建 | 第83-84页 |
| 3.2.4.9 甘油脱水酶的再激活反应 | 第84-86页 |
| 3.3 结果和讨论 | 第86-96页 |
| 3.3.1 PCR扩增甘油脱水酶基因dhaB及序列分析 | 第86页 |
| 3.3.2 重组表达载体的构建和酶切鉴定 | 第86-90页 |
| 3.3.3 重组甘油脱水酶的表达 | 第90-92页 |
| 3.3.4 重组甘油脱水酶酶活测定 | 第92页 |
| 3.3.5 重组甘油脱水酶的纯化和序列测定 | 第92-93页 |
| 3.3.6 甘油脱水酶再激活因子的克隆及表达载体的构建 | 第93-96页 |
| 3.3.6.1 甘油脱水酶再激活因子基因gdrAB的克隆 | 第93-94页 |
| 3.3.6.2 再激活因子表达载体的构建 | 第94-95页 |
| 3.3.6.3 甘油脱水酶再激活因子的表达 | 第95-96页 |
| 3.3.7 再激活因子对甘油脱水酶的再激活作用 | 第96页 |
| 3.4 小结 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-100页 |
| 第四章 大肠杆菌中共表达1,3-丙二醇关键酶基因及重组大肠杆菌的发酵 | 第100-116页 |
| 4.1 引言 | 第100-101页 |
| 4.2 材料和方法 | 第101-106页 |
| 4.2.1 菌株和质粒 | 第101页 |
| 4.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第101页 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 | 第101-102页 |
| 4.2.3.1 菌种培养基 | 第101页 |
| 4.2.3.2 发酵用培养基和培养条件 | 第101-102页 |
| 4.2.4 实验方法 | 第102-106页 |
| 4.2.4.1 dhaB与dhaT共表达载体的构建 | 第102-103页 |
| 4.2.4.2 重组载体pET-22b-gdrAB的构建 | 第103页 |
| 4.2.4.3 重组质粒pET-28a-dhaBT和pET-22b-gdrAB共转化E.coli BL21(DE3) | 第103-104页 |
| 4.2.4.4 不相容质粒稳定性测定 | 第104页 |
| 4.2.4.5 重组菌共表达甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶及再激活因子 | 第104页 |
| 4.2.4.6 yqhD替代dhaT的重组菌的构建和发酵 | 第104页 |
| 4.2.4.7 发酵液中甘油的测定方法-改进的高碘酸钠氧化法 | 第104-105页 |
| 4.2.4.8 发酵液中葡萄糖的测定方法 | 第105页 |
| 4.2.4.9 发酵液中代谢产物的高效液相色谱分析 | 第105-106页 |
| 4.3 结果和讨论 | 第106-112页 |
| 4.3.1 重组表达载体pET-28a-dhaBT的构建 | 第106-109页 |
| 4.3.2 重组载体pET-22b-gdrAB的酶切鉴定 | 第109页 |
| 4.3.3 重组质粒pET-28a-dhaBT和pET-22b-gdrAB共转化E.coil BL21(DE3)及不相容质粒稳定性的测定 | 第109-110页 |
| 4.3.4 重组菌共表达甘油脱水酶、1,3-丙二醇氧化还原酶及再激活因子 | 第110-111页 |
| 4.3.5 重组菌的批式流加发酵 | 第111-112页 |
| 4.3.6 yqhD替代dhaT的重组菌的构建和发酵 | 第112页 |
| 4.4 小结 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-116页 |
| 第五章 克雷伯肺炎杆菌中质粒载体的构建及1,3-丙二醇代谢途径关键酶活性的增强 | 第116-130页 |
| 5.1 引言 | 第116页 |
| 5.2 材料和方法 | 第116-121页 |
| 5.2.1 菌株和质粒 | 第116-117页 |
| 5.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第117页 |
| 5.2.3 培养基 | 第117页 |
| 5.2.4 实验方法 | 第117-121页 |
| 5.2.4.1 克雷伯肺炎杆菌基因组及大肠杆菌基因组DNA的提取 | 第117页 |
| 5.2.4.2 克雷伯肺炎杆菌感受态细胞的制备 | 第117-118页 |
| 5.2.4.3 重组质粒pKP-28a-dhaBY的构建 | 第118-120页 |
| 5.2.4.4 重组质粒pKP-28a-dhaBY在K.pneumoniae中的稳定性 | 第120-121页 |
| 5.2.4.5 重组质粒pKP-28a-dhaBY在K.pneumoniae中的表达 | 第121页 |
| 5.2.4.6 细胞粗提液的制备及酶活分析 | 第121页 |
| 5.3 结果和讨论 | 第121-128页 |
| 5.3.1 E.coli K12基因组的提取 | 第121-122页 |
| 5.3.2 大肠杆菌醇氧化还原酶基因(yqhD)的克隆 | 第122-123页 |
| 5.3.3 组成型启动子Pk的克隆 | 第123-124页 |
| 5.3.4 重组质粒pKP-28a-dhaBY的构建及鉴定 | 第124-125页 |
| 5.3.5 重组质粒pKP-28a-dhaBY在K.pneumoniae中的稳定性 | 第125-126页 |
| 5.3.6 重组质粒pKP-28a-dhaBY在K.pneumoniae中的表达 | 第126-127页 |
| 5.3.7 重组菌中关键酶酶活分析 | 第127-128页 |
| 5.4 小结 | 第128页 |
| 参考文献 | 第128-130页 |
| 第六章 重组克雷伯肺炎杆菌发酵产1,3-丙二醇 | 第130-140页 |
| 6.1 引言 | 第130页 |
| 6.2 材料和方法 | 第130-132页 |
| 6.2.1 菌株和质粒 | 第130-131页 |
| 6.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第131页 |
| 6.2.3 培养基 | 第131页 |
| 6.2.4 发酵条件和培养方法 | 第131-132页 |
| 6.2.5 发酵参数分析 | 第132页 |
| 6.2.5.1 生物量的测定 | 第132页 |
| 6.2.5.2 底物和产物的测定 | 第132页 |
| 6.3 结果和讨论 | 第132-137页 |
| 6.3.1 供氧对重组克雷伯肺炎杆菌产1,3-丙二醇的影响 | 第132-133页 |
| 6.3.2 底物浓度对发酵的影响—底物抑制现象 | 第133-134页 |
| 6.3.3 葡萄糖作为辅助碳源对重组克雷伯肺炎杆菌产1,3-丙二醇的影响 | 第134-135页 |
| 6.3.3.1 发酵初始加糖对1,3-丙二醇发酵的影响 | 第134-135页 |
| 6.3.3.2 补料加糖对1,3-丙二醇发酵的影响 | 第135页 |
| 6.3.4 微氧条件下初始和补料均加糖时1,3-丙二醇的发酵 | 第135-137页 |
| 6.4 小结 | 第137页 |
| 参考文献 | 第137-140页 |
| 第七章 复合诱变联合菌种驯化提高重组菌的产物耐受性 | 第140-152页 |
| 7.1 引言 | 第140-141页 |
| 7.2 材料和方法 | 第141-143页 |
| 7.2.1 菌株 | 第141页 |
| 7.2.2 培养基 | 第141页 |
| 7.2.3 实验方法 | 第141-143页 |
| 7.2.3.1 紫外诱变 | 第141-142页 |
| 7.2.3.2 菌种驯化 | 第142页 |
| 7.2.3.3 摇瓶筛选 | 第142页 |
| 7.2.3.4 发酵实验 | 第142-143页 |
| 7.2.3.5 发酵参数分析 | 第143页 |
| 7.3 结果和讨论 | 第143-149页 |
| 7.3.1 诱变结果 | 第143-144页 |
| 7.3.2 驯化结果 | 第144-145页 |
| 7.3.3 摇瓶筛选 | 第145-147页 |
| 7.3.4 发酵罐实验 | 第147-149页 |
| 7.4 小结 | 第149-150页 |
| 参考文献 | 第150-152页 |
| 第八章 重组菌副产物乙醇途径中醛脱氢酶基因aldH的敲除及突变株的发酵 | 第152-164页 |
| 8.1 引言 | 第152-153页 |
| 8.2 材料和方法 | 第153-156页 |
| 8.2.1 菌株和质粒 | 第153页 |
| 8.2.2 试验试剂及仪器设备 | 第153页 |
| 8.2.3 培养基 | 第153-154页 |
| 8.2.4 实验方法 | 第154-156页 |
| 8.2.4.1 克雷伯肺炎杆菌基因组的提取 | 第154页 |
| 8.2.4.2 克雷伯肺炎杆菌感受态细胞的制备 | 第154页 |
| 8.2.4.3 乙醛脱氢酶基因(aldH)的克隆 | 第154页 |
| 8.2.4.4 PCR扩增四环素抗性基因(Tet) | 第154页 |
| 8.2.4.5 重组质粒pMD18-T-aldH-Tet的构建 | 第154-155页 |
| 8.2.4.6 同源重组构建aldH基因缺失的重组克雷伯肺炎杆菌 | 第155页 |
| 8.2.4.7 摇瓶筛选及基因组鉴定 | 第155页 |
| 8.2.4.8 发酵罐实验 | 第155-156页 |
| 8.2.4.9 发酵罐参数分析 | 第156页 |
| 8.3 结果和讨论 | 第156-161页 |
| 8.3.1 乙醛脱氢酶基因(aldH)的克隆 | 第156-157页 |
| 8.3.2 PCR扩增四环素编码基因Tet | 第157-158页 |
| 8.3.3 基因敲除载体pMD18-T-aldH-Tet的构建和鉴定 | 第158页 |
| 8.3.4 aldH基因缺失的重组克雷伯肺炎杆菌的构建 | 第158页 |
| 8.3.5 摇瓶筛选及基因组PCR鉴定 | 第158-160页 |
| 8.3.6 发酵罐实验 | 第160-161页 |
| 8.4 小结 | 第161-162页 |
| 参考文献 | 第162-164页 |
| 第九章 实验总结与建议 | 第164-168页 |
| 9.1 本论文得到的主要结果 | 第164-166页 |
| 9.2 本论文的创新点 | 第166页 |
| 9.3 本论文结果工业化前景 | 第166-167页 |
| 9.4 问题与建议 | 第167-168页 |
| 附录1 试剂 | 第168-170页 |
| 附录2 仪器与设备 | 第170-171页 |
| 致谢 | 第171-172页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第172-174页 |
| 作者和导师简介 | 第174页 |
