| 中文摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6页 |
| 主要符号表 | 第11-12页 |
| 引言 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-20页 |
| 1.1 基因组定点编辑技术 | 第13-16页 |
| 1.1.1 工程核酸酶精确的编辑基因 | 第14页 |
| 1.1.2 Cas9: RNA介导的基因组编辑 | 第14-15页 |
| 1.1.3 与其他基因组编辑技术的比较 | 第15-16页 |
| 1.1.4 Cas9 系统的局限性 | 第16页 |
| 1.2 肌肉生长抑制素基因的研究进展 | 第16页 |
| 1.2.1 MSTN基因的概述 | 第16页 |
| 1.2.2 MSTN基因的调控及生物学功能 | 第16页 |
| 1.3 友好位点的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.3.1 H2-Tw3位点 | 第17页 |
| 1.3.2 Hprt位点 | 第17页 |
| 1.3.3 Rosa26位点 | 第17-18页 |
| 1.3.4 Hipp11 (H11)位点 | 第18页 |
| 1.4 超数排卵的研究 | 第18-20页 |
| 第二章 CRISPR介导的兔体细胞基因敲除研究 | 第20-29页 |
| 1 材料与方法 | 第20-24页 |
| 1.1 主要试剂及主要试剂配制 | 第20页 |
| 1.1.1 主要试剂 | 第20页 |
| 1.1.2 主要试剂配制 | 第20页 |
| 1.2 主要仪器 | 第20-21页 |
| 1.3 引物序列及测序 | 第21页 |
| 1.4 试验方法 | 第21-24页 |
| 1.4.1 试验设计方案 | 第21页 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9作用靶点确定及sgRNA的设计与合成 | 第21-22页 |
| 1.4.3 Cas9表达载体的构建 | 第22-23页 |
| 1.4.4 兔胚胎成纤维细胞的分离及培养 | 第23-24页 |
| 1.4.5 CRISPR/Cas9去内毒素质粒的提取 | 第24页 |
| 1.4.6 电转染家兔胚胎成纤维细胞 | 第24页 |
| 2 结果与分析 | 第24-28页 |
| 2.1 靶位点的确定及sgRNA设计 | 第24-25页 |
| 2.2 Cas9/gRNA表达载体的构建和鉴定 | 第25页 |
| 2.3 载体构建测序结果 | 第25-26页 |
| 2.4 EGFP的表达及转染效率 | 第26页 |
| 2.5 Cas9/gRNA敲除效率 | 第26-28页 |
| 3 讨论 | 第28页 |
| 4 结论 | 第28-29页 |
| 第三章 CRISPR介导GFP在兔体细胞定点整合研究 | 第29-52页 |
| 1 材料和方法 | 第29-36页 |
| 1.1 主要试剂 | 第29页 |
| 1.2 主要仪器 | 第29页 |
| 1.3 引物序列及测序 | 第29页 |
| 1.4 试验方法 | 第29-36页 |
| 1.4.1 试验设计方案 | 第29页 |
| 1.4.2 序列比对 | 第29-30页 |
| 1.4.3 sgRNA的设计和制备 | 第30页 |
| 1.4.4 构建CRISPR/Cas9敲除载体 | 第30页 |
| 1.4.5 引物设计 | 第30-31页 |
| 1.4.6 同源打靶载体的构建 | 第31-35页 |
| 1.4.7 兔胚胎成纤维细胞的复苏 | 第35页 |
| 1.4.8 嘌呤霉素筛选兔胚胎成纤维细胞浓度确定 | 第35页 |
| 1.4.9 敲除载体与同源打靶载体共转染兔胚胎成纤维细胞 | 第35-36页 |
| 1.4.10 嘌呤霉素筛选细胞 | 第36页 |
| 1.4.11 打靶细胞的检测 | 第36页 |
| 2 结果与分析 | 第36-50页 |
| 2.1 猪与小鼠与人的H11位点周围环境序列比对结果 | 第36-38页 |
| 2.2 家兔基因组鉴定小鼠Rosa 26 的同源性 | 第38-39页 |
| 2.3 CRISPR/Cas9的构建和活性分析 | 第39-40页 |
| 2.4 同源打靶载体的构建 | 第40-45页 |
| 2.4.1 pIRES2 -ZsGreen1-Puro载体的构建 | 第40-41页 |
| 2.4.2 pIRES2 -ZsGreen1-H11- Puro-3’Arm和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26- Puro-3’Arm载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.4.3 终载体pIRES2 -ZsGreen1-H11-Puro和pIRES2 -ZsGreen1-Rosa26-Puro | 第42-45页 |
| 2.5 细胞实验结果 | 第45-48页 |
| 2.5.1 嘌呤霉素最佳浓度的筛选 | 第45页 |
| 2.5.2 敲除载体与同源打靶载体共转染兔胚胎成纤维细胞 | 第45-48页 |
| 2.6 打靶细胞的检测 | 第48-50页 |
| 3 讨论 | 第50-51页 |
| 4 结论 | 第51-52页 |
| 第四章 兔胚胎的高效制备 | 第52-57页 |
| 1 材料和方法 | 第52-54页 |
| 1.1 材料 | 第52页 |
| 1.1.1 试验动物 | 第52页 |
| 1.1.2 试验药品和试验器械 | 第52页 |
| 1.2 家兔超数排卵的方法 | 第52-54页 |
| 1.2.1 PMSG+HCG | 第52-53页 |
| 1.2.2 FSH+HCG | 第53页 |
| 1.2.3 原核期供体兔胚胎的采集 | 第53页 |
| 1.2.4 统计分析 | 第53-54页 |
| 2 结果 | 第54-55页 |
| 2.1 不同剂量PMSG的超排效果 | 第54页 |
| 2.2 不同超排处理方法对母兔超排效果的影响 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-56页 |
| 3.1 不同剂量PMSG的超排效果 | 第55页 |
| 3.2 不同超排方法对母兔超排效果的影响 | 第55-56页 |
| 4 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-63页 |
| 导师评阅表 | 第63页 |
