| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩写符号术语表 | 第12-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-28页 |
| 1.1 Macrolatins的简介 | 第13-18页 |
| 1.1.1 Macrolactins的来源及分类 | 第13-16页 |
| 1.1.2 Macrolactins类物质的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.2 聚酮合成酶(PKSs)的研究现状 | 第18-21页 |
| 1.2.1 聚酮合成酶的分类及介绍 | 第18-19页 |
| 1.2.2 聚酮类化合物的研究进展 | 第19-21页 |
| 1.3 解淀粉芽孢杆菌基因改造的研究进展 | 第21-25页 |
| 1.3.1 解淀粉芽孢杆菌简介 | 第21-22页 |
| 1.3.2 解淀粉芽孢杆菌基因的异源表达 | 第22-23页 |
| 1.3.3 解淀粉芽孢杆菌基因的原位改造 | 第23-25页 |
| 1.4 启动子改造在解淀粉芽孢杆菌中的应用 | 第25-27页 |
| 1.5 本课题的研究思路与主要内容 | 第27-28页 |
| 第二章 PKS基因簇启动子的定位与分析 | 第28-43页 |
| 2.1 前言 | 第28页 |
| 2.2 材料及试剂 | 第28-29页 |
| 2.2.1 菌种、质粒和引物 | 第28页 |
| 2.2.2 实验仪器及设备 | 第28页 |
| 2.2.3 实验试剂和药品 | 第28页 |
| 2.2.4 培养基及试剂的配制 | 第28-29页 |
| 2.3 实验方法 | 第29-35页 |
| 2.3.1 菌种鉴定 | 第29-31页 |
| 2.3.2 PKS基因簇的确定及其启动子区域的定位 | 第31页 |
| 2.3.3 启动子检测载体的构建 | 第31-33页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备(试剂盒) | 第33页 |
| 2.3.5 重组质粒转化E.coli DH5α及其验证 | 第33页 |
| 2.3.6 启动子活性分析 | 第33-34页 |
| 2.3.7 温度对启动子强度的影响 | 第34页 |
| 2.3.8 葡萄糖对启动子强度的影响 | 第34-35页 |
| 2.4 实验结果及讨论 | 第35-42页 |
| 2.4.1 抗生素产生菌株的鉴定 | 第35-36页 |
| 2.4.2 PKS基因簇的定位 | 第36-37页 |
| 2.4.3 启动子区域的定位 | 第37-38页 |
| 2.4.4 启动子检测载体的构建结果 | 第38-39页 |
| 2.4.5 启动子活性分析结果 | 第39-40页 |
| 2.4.6 温度对启动子表达的影响 | 第40-41页 |
| 2.4.7 葡萄糖对启动子活性的影响 | 第41-42页 |
| 2.5 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 启动子突变文库的构建 | 第43-54页 |
| 3.1 前言 | 第43页 |
| 3.2 实验材料及方法 | 第43-44页 |
| 3.2.1 菌种、质粒和引物 | 第43页 |
| 3.2.2 仪器及设备 | 第43页 |
| 3.2.3 主要试剂和药品 | 第43页 |
| 3.2.4 培养基及试剂的配制 | 第43-44页 |
| 3.3 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.3.1 普通的PCR方法 | 第44页 |
| 3.3.2 利用聚合酶环形延伸克隆(CPEC)构建启动子突变文库 | 第44-46页 |
| 3.3.3 聚合酶环形延伸克隆条件的优化 | 第46-47页 |
| 3.3.4 突变子的初筛 | 第47-48页 |
| 3.3.5 突变子的复筛 | 第48页 |
| 3.4 实验结果及讨论 | 第48-53页 |
| 3.4.1 目的基因与线性载体的PCR结果及验证 | 第48-49页 |
| 3.4.2 CPEC克隆中最适的退火温度 | 第49-50页 |
| 3.4.3 CPEC克隆中最适的PCR循环数 | 第50-51页 |
| 3.4.4 启动子突变文库初筛结果及验证 | 第51-52页 |
| 3.4.5 突变子的复筛及最优启动子的确定 | 第52-53页 |
| 3.5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 同源重组法敲除解淀粉芽孢杆菌基因的研究 | 第54-68页 |
| 4.1 前言 | 第54页 |
| 4.2 实验材料及方法 | 第54-55页 |
| 4.2.1 菌种、质粒和引物 | 第54页 |
| 4.2.2 仪器及设备 | 第54页 |
| 4.2.3 主要试剂和药品 | 第54页 |
| 4.2.4 培养基及试剂的配制 | 第54-55页 |
| 4.3 实验方法 | 第55-58页 |
| 4.3.1 以mazF毒蛋白为反筛标记的整合载体pIEFMLN的构建 | 第55页 |
| 4.3.2 解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备 | 第55-56页 |
| 4.3.3 电转化方法 | 第56页 |
| 4.3.4 影响转化效率的参数的优化 | 第56-57页 |
| 4.3.5 PKS基因簇启动子的敲除 | 第57-58页 |
| 4.4 实验结果及讨论 | 第58-67页 |
| 4.4.1 以mazF毒蛋白为反筛标记的整合载体pIEFMLN的验证 | 第58-59页 |
| 4.4.2 影响转化效率的参数优化结果 | 第59-63页 |
| 4.4.3 PKS基因簇启动子的敲除及验证结果 | 第63-67页 |
| 4.5 本章小结 | 第67-68页 |
| 第五章 CRISPR-Cas9基因敲除载体的构建 | 第68-76页 |
| 5.1 前言 | 第68页 |
| 5.2 实验材料及方法 | 第68-69页 |
| 5.2.1 菌种、质粒和引物 | 第68页 |
| 5.2.2 仪器及设备 | 第68-69页 |
| 5.2.3 主要试剂和药品 | 第69页 |
| 5.2.4 培养基及试剂的配制 | 第69页 |
| 5.3 实验方法 | 第69-71页 |
| 5.3.1 插入sgRNA和N20元件构建载体pHYSg | 第69-70页 |
| 5.3.2 插入温敏型复制子pWV01构建载体pHYSgTs | 第70页 |
| 5.3.3 插入Cas9元件构建载体pHYSgTsCas9 | 第70页 |
| 5.3.4 插入修复模板构建敲除载体pHYpCasMLN | 第70-71页 |
| 5.3.5 敲除载体pHYpCasMLN的电转化 | 第71页 |
| 5.4 实验结果及讨论 | 第71-75页 |
| 5.4.1 pHYSg载体构建结果及验证 | 第72页 |
| 5.4.2 pHYSgTs载体构建结果及验证 | 第72-73页 |
| 5.4.3 pHYSgTsCas9载体构建结果及验证 | 第73-74页 |
| 5.4.4 pHYpCasMLN载体构建结果及验证 | 第74页 |
| 5.4.5 pHYpCasMLN载体的转化结果 | 第74-75页 |
| 5.5 本章小结 | 第75-76页 |
| 第六章 结论及展望 | 第76-78页 |
| 6.1 结论 | 第76-77页 |
| 6.2 展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-85页 |
| 附录 | 第85-92页 |
| 作者简介 | 第92页 |
