| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-24页 |
| ·概述 | 第12-14页 |
| ·维生素 C 的性质与应用 | 第12页 |
| ·维生素 C 的生产方法 | 第12-14页 |
| ·一步发酵法生产 2-KLG 的前期研究 | 第14-17页 |
| ·基于经典二步发酵法的研究 | 第14-16页 |
| ·基于新二步发酵法的研究 | 第16页 |
| ·基于高等生物中维生素 C 合成途径的研究 | 第16-17页 |
| ·一步发酵法生产维生素 C 面临的问题 | 第17-21页 |
| ·2-KLG 合成过程中相关醇糖脱氢酶的鉴定 | 第17-18页 |
| ·醇糖跨膜转运系统研究 | 第18-19页 |
| ·2-KLG 降解途径研究 | 第19页 |
| ·辅酶 PQQ 的合成与再生研究 | 第19-20页 |
| ·2-KLG 合成途径在其它模式菌株中的构建 | 第20-21页 |
| ·代谢网络的全局优化 | 第21页 |
| ·选题的立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第21-24页 |
| ·立题依据及研究意义 | 第21-22页 |
| ·本文主要研究内容 | 第22-24页 |
| 第二章 2-KLG 合成关键基因的克隆与鉴定 | 第24-40页 |
| ·前言 | 第24页 |
| ·材料与方法 | 第24-28页 |
| ·菌株和质粒 | 第24页 |
| ·试剂和仪器 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·DNA 操作 | 第25-26页 |
| ·脱氢酶的预测 | 第26页 |
| ·系统进化树分析 | 第26页 |
| ·关键酶在大肠杆菌中的表达 | 第26-27页 |
| ·培养条件 | 第27页 |
| ·酶的制备与纯化 | 第27页 |
| ·十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE) | 第27页 |
| ·酶活测定 | 第27-28页 |
| ·酶学性质测定 | 第28页 |
| ·体外催化反应产物的测定 | 第28页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第28页 |
| ·结果与讨论 | 第28-39页 |
| ·关键脱氢酶的预测 | 第28-34页 |
| ·跨膜区域分析 | 第34页 |
| ·SDH 及 SNDH 在大肠杆菌中的表达 | 第34-35页 |
| ·SDH 及 SNDH 的酶活测定 | 第35-36页 |
| ·SDH/SNDH 及 SNDH 动力学参数分析 | 第36-37页 |
| ·SDH/SNDH 及 SNDH 体外催化特性分析 | 第37-39页 |
| ·本章小结 | 第39-40页 |
| 第三章 分子改造大肠杆菌一步发酵生产 2-KLG | 第40-48页 |
| ·前言 | 第40页 |
| ·材料方法 | 第40-41页 |
| ·菌株和质粒 | 第40页 |
| ·试剂和仪器 | 第40页 |
| ·培养基 | 第40页 |
| ·DNA 操作 | 第40页 |
| ·E. coli 一步工程菌的构建 | 第40-41页 |
| ·SDS-PAGE 电泳分析 | 第41页 |
| ·一步工程菌发酵 | 第41页 |
| ·体外催化 | 第41页 |
| ·结果与讨论 | 第41-47页 |
| ·E. coli 对 2-KLG 的耐受性及降解能力分析 | 第41-42页 |
| ·一步工程菌 E. coli/pET-2142- 0095-pRSF-sldh-pqq 的构建 | 第42-44页 |
| ·关键酶在 E. coli 中的表达 | 第44页 |
| ·一步工程菌表达酶液的体外催化反应 | 第44-45页 |
| ·一步工程菌的发酵验证 | 第45-47页 |
| ·本章小结 | 第47-48页 |
| 第四章 氧化葡萄糖酸杆菌全基因组测序及基因操作系统的构建 | 第48-58页 |
| ·前言 | 第48页 |
| ·材料方法 | 第48-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第48页 |
| ·试剂和仪器 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·DNA 操作 | 第48页 |
| ·全基因组序列测定 | 第48-49页 |
| ·ORF 预测与注释 | 第49页 |
| ·G. oxydans 操作系统的构建 | 第49页 |
| ·质粒稳定性检测 | 第49页 |
| ·结果与讨论 | 第49-55页 |
| ·基因组的基本特性 | 第49-51页 |
| ·碳水化合物及醇类等物质的代谢 | 第51-52页 |
| ·山梨糖合成相关酶及辅酶编码基因 | 第52页 |
| ·G. oxydans WSH-003 系统发育分析 | 第52-53页 |
| ·G. oxydans WSH-003 对 2-KLG 的耐受性及降解能力分析 | 第53-54页 |
| ·G. oxydans 基因操作系统的构建 | 第54-55页 |
| ·本章小结 | 第55-58页 |
| 第五章 氧化葡萄糖酸杆菌工程菌的构建及利用连接肽工程与辅因子工程对一步工程菌的改造 | 第58-70页 |
| ·前言 | 第58页 |
| ·材料方法 | 第58-61页 |
| ·菌株和质粒 | 第58页 |
| ·试剂和仪器 | 第58页 |
| ·培养基 | 第58页 |
| ·DNA 操作 | 第58页 |
| ·不同组合一步工程菌的构建 | 第58-59页 |
| ·融合表达一步工程菌的构建 | 第59页 |
| ·一步工程菌中辅酶 PQQ 合成基因的表达 | 第59-61页 |
| ·发酵液成分质谱检测 | 第61页 |
| ·PQQ 浓度测定 | 第61页 |
| ·结果与讨论 | 第61-68页 |
| ·不同组合的 SDH/SNDH 与 SNDH 在 G. oxydans 中的表达 | 第61-62页 |
| ·一步工程菌发酵验证 | 第62-64页 |
| ·SDH/SNDH 和 SNDH 的融合表达提高 2-KLG 的产量 | 第64-66页 |
| ·一步工程菌发酵培养基 N 源浓度的优化 | 第66页 |
| ·通过增加辅酶 PQQ 的含量提高 2-KLG 产量 | 第66-68页 |
| ·本章小结 | 第68-70页 |
| 第六章 基于耐热交联蛋白 CutA 对氧化葡萄糖酸杆菌一步工程菌的改造 | 第70-77页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·材料方法 | 第70-71页 |
| ·菌株和质粒 | 第70页 |
| ·试剂和仪器 | 第70页 |
| ·培养基 | 第70页 |
| ·DNA 操作 | 第70页 |
| ·k0203-GGGGS-k0095 密码子优化 | 第70页 |
| ·耐热交联蛋白 CutA 在 G. oxydans 中的表达 | 第70页 |
| ·基于耐热交联蛋白 CutA 一步工程菌的构建 | 第70-71页 |
| ·结果与讨论 | 第71-75页 |
| ·密码子优化提高 2-KLG 产量 | 第71页 |
| ·耐热交联蛋白 CutA 在 G. oxydans 中的表达 | 第71-72页 |
| ·基于 CutA 对 SDH/SNDH 及 SNDH 的表达 | 第72-73页 |
| ·基于 CutA 构建的一步工程菌发酵验证 | 第73-74页 |
| ·基于 CutA 构建的一步工程菌在不同温度下的发酵 | 第74页 |
| ·通过增加辅酶 PQQ 的含量提高 2-KLG 产量 | 第74-75页 |
| ·本章小结 | 第75-77页 |
| 主要结论与展望 | 第77-80页 |
| 主要结论 | 第77-79页 |
| 展望 | 第79-80页 |
| 论文主要创新点 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-91页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表论文 | 第91页 |
