| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-23页 |
| ·概述 | 第11-16页 |
| ·弹性蛋白酶简介 | 第11-12页 |
| ·弹性蛋白酶的酶学性质 | 第12页 |
| ·弹性蛋白酶的应用 | 第12-13页 |
| ·弹性蛋白酶的空间结构 | 第13-14页 |
| ·弹性蛋白酶的成熟与分泌 | 第14-16页 |
| ·弹性蛋白酶基因的异源表达 | 第16-17页 |
| ·在大肠杆菌中表达 | 第16-17页 |
| ·在毕赤酵母中表达 | 第17页 |
| ·N-糖基化对毕赤酵母表达重组酶的影响 | 第17-21页 |
| ·N-糖基化对酶稳定性的影响 | 第18页 |
| ·N-糖基化对酶活性的影响 | 第18-19页 |
| ·N-糖基化对蛋白表达的影响 | 第19-21页 |
| ·本论文研究的意义和主要研究内容 | 第21-23页 |
| ·本论文研究的意义 | 第21-22页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第22-23页 |
| 第二章 产弹性蛋白酶菌株的鉴定和酶蛋白的鉴定及酶学性质 | 第23-37页 |
| ·引言 | 第23页 |
| ·材料与方法 | 第23-26页 |
| ·主要试剂和菌株 | 第23页 |
| ·主要实验仪器 | 第23-24页 |
| ·培养基与培养条件 | 第24页 |
| ·菌株鉴定 | 第24-25页 |
| ·蛋白酶的分析方法 | 第25页 |
| ·弹性蛋白酶的纯化 | 第25-26页 |
| ·弹性蛋白酶的肽质量指纹图谱鉴定 | 第26页 |
| ·弹性蛋白酶的酶学性质 | 第26页 |
| ·结果与讨论 | 第26-36页 |
| ·产蛋白酶菌株的筛选 | 第26-27页 |
| ·菌株C11 对有机溶剂的耐受性 | 第27-28页 |
| ·菌株鉴定 | 第28-30页 |
| ·弹性蛋白酶的纯化 | 第30-33页 |
| ·弹性蛋白酶的肽质量指纹图谱鉴定 | 第33页 |
| ·弹性蛋白酶的酶学性质 | 第33-36页 |
| ·本章小结 | 第36-37页 |
| 第三章 弹性蛋白酶基因的克隆与表达及重组酶的酶学性质 | 第37-50页 |
| ·引言 | 第37页 |
| ·材料与方法 | 第37-42页 |
| ·菌株、质粒与主要试剂 | 第37页 |
| ·主要实验设备 | 第37-38页 |
| ·大肠杆菌感受态制备及质粒转化 | 第38页 |
| ·P. aeruginosa C11 基因组的提取 | 第38页 |
| ·PCR | 第38-39页 |
| ·目的基因的测序 | 第39-40页 |
| ·目的基因的亚克隆 | 第40页 |
| ·目的基因在毕赤酵母中表达 | 第40-41页 |
| ·酶蛋白的纯化 | 第41页 |
| ·酶蛋白的检测 | 第41页 |
| ·酶蛋白的热稳定性 | 第41-42页 |
| ·酶蛋白在有机溶剂中的稳定性 | 第42页 |
| ·酶的动力学参数测定 | 第42页 |
| ·结果与讨论 | 第42-49页 |
| ·目的基因提取 | 第42页 |
| ·P. aeruginosa C11 的lasB基因测序 | 第42-43页 |
| ·重组弹性蛋白酶的表达与纯化 | 第43-44页 |
| ·重组弹性蛋白酶的酶学特性 | 第44-49页 |
| ·本章小结 | 第49-50页 |
| 第四章 重组弹性蛋白酶在有机溶剂中催化合成二肽的研究 | 第50-59页 |
| ·引言 | 第50页 |
| ·材料与方法 | 第50-51页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·主要实验设备 | 第50页 |
| ·酶蛋白的纯化 | 第50-51页 |
| ·肽合成的反应条件 | 第51页 |
| ·HPLC | 第51页 |
| ·结果与讨论 | 第51-58页 |
| ·有机溶剂种类对肽合成的影响 | 第51-53页 |
| ·重组酶催化二肽合成的底物特异性 | 第53-54页 |
| ·DMSO浓度对肽合成反应得率的影响 | 第54-55页 |
| ·pH对肽合成反应得率的影响 | 第55页 |
| ·温度对肽合成反应得率的影响 | 第55-57页 |
| ·酶浓度对肽合成反应得率的影响 | 第57页 |
| ·反应时间对肽合成反应得率的影响 | 第57-58页 |
| ·本章小结 | 第58-59页 |
| 第五章 去N-糖基化位点对重组弹性蛋白酶的影响 | 第59-71页 |
| ·引言 | 第59页 |
| ·材料与方法 | 第59-63页 |
| ·菌株、质粒与主要试剂 | 第59页 |
| ·主要实验仪器 | 第59页 |
| ·去N-糖基化位点突变 | 第59-62页 |
| ·突变酶蛋白的纯化 | 第62页 |
| ·蛋白去N-糖基化 | 第62页 |
| ·突变蛋白检测 | 第62页 |
| ·蛋白电泳凝胶银染 | 第62页 |
| ·酶学性质 | 第62-63页 |
| ·合成多肽条件及产物检测 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-70页 |
| ·突变重组酶蛋白的N-糖基化分析 | 第63-64页 |
| ·去N-糖基化位点对重组酶热稳定性的影响 | 第64-65页 |
| ·去N-糖基化位点对重组酶在有机溶剂中稳定性的影响 | 第65-66页 |
| ·去N-糖基化位点对重组酶水解酪蛋白活性的影响 | 第66页 |
| ·去N-糖基化位点对重组酶在有机溶剂中活性的影响 | 第66-68页 |
| ·去N-糖基化位点对重组酶表达量的影响 | 第68-70页 |
| ·本章小结 | 第70-71页 |
| 第六章 引入N-糖基化位点对重组弹性蛋白酶的影响 | 第71-82页 |
| ·引言 | 第71页 |
| ·材料与方法 | 第71-74页 |
| ·菌株、质粒与主要试剂 | 第71页 |
| ·主要实验仪器 | 第71页 |
| ·引入的N-糖基化位点突变 | 第71-73页 |
| ·突变酶蛋白的纯化 | 第73页 |
| ·突变酶蛋白的检测 | 第73-74页 |
| ·突变蛋白的酶学性质 | 第74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-80页 |
| ·突变酶蛋白的N-糖基化分析 | 第74页 |
| ·引入N-糖基化位点对重组酶热稳定性的影响 | 第74-75页 |
| ·引入N-糖基化位点对重组酶在有机溶剂中稳定性的影响 | 第75-76页 |
| ·引入N-糖基化位点对重组酶酪蛋白酶活力的影响 | 第76页 |
| ·引入N-糖基化位点对重组酶在有机溶剂中活性的影响 | 第76-77页 |
| ·酶浓度对突变蛋白酶催化二肽合成的影响 | 第77-79页 |
| ·引入N-糖基化位点对重组酶表达量的影响 | 第79-80页 |
| ·本章小结 | 第80-82页 |
| 主要结论与展望 | 第82-84页 |
| 论文主要创新点 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-86页 |
| 参考文献 | 第86-95页 |
| 附录 | 第95-104页 |
