| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第10-11页 |
| 第一章 概述 | 第11-20页 |
| 1.1 CRISPR/Cas系统 | 第11-12页 |
| 1.2 CRISPR/Cas系统在细胞中的应用 | 第12-14页 |
| 1.3 CRISPR/Cas系统的分类 | 第14-15页 |
| 1.4 I-B-Svi型CRISPR/Cas系统发现 | 第15-16页 |
| 1.5 I-B-Svi型CRISPR/Cas3系统 | 第16-17页 |
| 1.6 CRISPR/Cas3打靶基因信息 | 第17-18页 |
| 1.6.1 drosha基因 | 第17-18页 |
| 1.6.2 vegfa基因 | 第18页 |
| 1.7 本课题研究目的、内容,及研究意义 | 第18-20页 |
| 第二章 CRISPR-sCas3系统在3T3细胞中的基因编辑 | 第20-56页 |
| 2.1 前言 | 第20页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第20-27页 |
| 2.2.1 细胞 | 第20-21页 |
| 2.2.2 菌株与质粒 | 第21-22页 |
| 2.2.3 试剂/药品、试剂盒 | 第22-24页 |
| 2.2.4 溶液/培养基的配制 | 第24-25页 |
| 2.2.5 使用仪器 | 第25-27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-44页 |
| 2.3.1 vegfa基因gRNA序列的设计与合成 | 第27-30页 |
| 2.3.2 vegfa基因同源修复模版tDNA的设计及扩增 | 第30-32页 |
| 2.3.3 引物序列的设计及合成 | 第32-33页 |
| 2.3.4 E.coli TOP10和3T3细胞的培养 | 第33-35页 |
| 2.3.5 3T3细胞基因组以及质粒的的提取 | 第35-37页 |
| 2.3.6 质粒构建元件的PCR扩增及纯化 | 第37-39页 |
| 2.3.7 质粒的构建 | 第39-42页 |
| 2.3.8 TOP10菌株感受态的制备 | 第42-43页 |
| 2.3.9 质粒转化及验证 | 第43页 |
| 2.3.10 3T3细胞的转染及基因组编辑验证 | 第43-44页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第44-55页 |
| 2.4.1 3T3细胞基因组及原始质粒的提取 | 第44-45页 |
| 2.4.2 CRISPR-hCas9质粒线性化 | 第45-46页 |
| 2.4.3 vegfa gDNA构建元件的制备 | 第46-47页 |
| 2.4.4 3T3细胞同源交换模板t-vegfa::egfp的制备 | 第47-48页 |
| 2.4.5 scas3片段PCR扩增结果 | 第48-49页 |
| 2.4.6 CRISPR-sCas3质粒的构建 | 第49-50页 |
| 2.4.7 CRISPR-hCas9-t/g(vegfa)和CRISPR-sCas3-t/g(vegfa)质粒的构建结果 | 第50-52页 |
| 2.4.8 NIH 3T3细胞vegfa基因靶位点同源重组修复结果 | 第52-55页 |
| 2.5 本章小结 | 第55-56页 |
| 第三章 碱基优化的CRISPR-hCas3系统在293T细胞中的基因编辑 | 第56-82页 |
| 3.1 前言 | 第56页 |
| 3.2 材料与仪器 | 第56-58页 |
| 3.2.1 细胞 | 第56-57页 |
| 3.2.2 菌株与质粒 | 第57-58页 |
| 3.2.3 试剂/药品、试剂盒 | 第58页 |
| 3.2.4 实验仪器 | 第58页 |
| 3.3 实验方法 | 第58-70页 |
| 3.3.1 drosha基因gRNA序列的设计及合成 | 第59-60页 |
| 3.3.2 drosha基因同源修复模版tDNA的设计及扩增 | 第60-61页 |
| 3.3.3 引物序列 | 第61-62页 |
| 3.3.4 cas3序列的碱基优化 | 第62-64页 |
| 3.3.5 293T细胞的培养 | 第64页 |
| 3.3.6 293T细胞基因组的提取和质粒的抽提 | 第64页 |
| 3.3.7 质粒构建元件 | 第64-67页 |
| 3.3.8 打靶质粒的构建 | 第67-69页 |
| 3.3.9 质粒的转化及验证 | 第69页 |
| 3.3.10 293T细胞的转染及基因组编辑验证 | 第69-70页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第70-81页 |
| 3.4.1 293T细胞基因组的提取 | 第70页 |
| 3.4.2 质粒构建元件的制备结果 | 第70-73页 |
| 3.4.3 AIO-Mcherry-hCas3质粒构建 | 第73-74页 |
| 3.4.4 AIO-Mcherry-hCas3-t/g质粒构建结果 | 第74-75页 |
| 3.4.5 293T细胞编辑结果验证 | 第75-81页 |
| 3.5 本章小结 | 第81-82页 |
| 第四章 脱靶分析 | 第82-89页 |
| 4.1 前言 | 第82页 |
| 4.2 脱靶位点序列分析 | 第82-84页 |
| 4.3 脱靶位点PCR分析 | 第84-85页 |
| 4.4 结果与分析 | 第85-88页 |
| 4.5 本章小结 | 第88-89页 |
| 第五章 总结与展望 | 第89-91页 |
| 5.1 总结 | 第89-90页 |
| 5.2 展望 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 附录 | 第97-101页 |
| 致谢 | 第101-102页 |
| 文章与专利 | 第102页 |
