| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 缩略词说明 | 第12-14页 |
| 前言 | 第14-20页 |
| 1.小分子抗体在大肠杆菌中的表达 | 第14-15页 |
| 2.小分子抗体在大肠杆菌中分泌表达的研究进展 | 第15-18页 |
| 3.本课题研究内容 | 第18-20页 |
| 第一章 抗VEGF抗体Fab片段表达载体构建及信号肽优化 | 第20-47页 |
| 1.1 材料 | 第21-28页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第21-22页 |
| 1.1.2 引物 | 第22页 |
| 1.1.3 培养基及溶液 | 第22-25页 |
| 1.1.4 试剂 | 第25-26页 |
| 1.1.5 分子量标志物 | 第26页 |
| 1.1.6 工具酶 | 第26页 |
| 1.1.7 试剂盒 | 第26页 |
| 1.1.8 生物信息学软件 | 第26页 |
| 1.1.9 统计学分析 | 第26-27页 |
| 1.1.10 主要仪器和设备 | 第27-28页 |
| 1.2 方法 | 第28-36页 |
| 1.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 | 第28页 |
| 1.2.2 质粒的提取 | 第28页 |
| 1.2.3 化学感受态细胞的制备与化学转化法 | 第28-29页 |
| 1.2.3.1 化学感受态细胞的制备(参照《分子克隆实验指南第三版》) | 第28-29页 |
| 1.2.3.2 化学转化法 | 第29页 |
| 1.2.4 构建信号肽突变体 | 第29页 |
| 1.2.5 构建Fab表达载体 | 第29-32页 |
| 1.2.6 不同表达菌株生长曲线的测定 | 第32页 |
| 1.2.7 全菌蛋白的SDS-PAGE分析及Western Blot | 第32-33页 |
| 1.2.8 Fab含量测定及分析 | 第33-34页 |
| 1.2.9 Protein L亲和层析柱纯化抗体片段Fab | 第34-35页 |
| 1.2.10 抗体蛋白Fab浓度的测定 | 第35-36页 |
| 1.2.10.1 BCA试剂盒测蛋白浓度 | 第35-36页 |
| 1.2.10.2 依据CurveExpert软件绘制标准曲线 | 第36页 |
| 1.3 结果 | 第36-46页 |
| 1.3.1 Fab表达载体的构建 | 第36-38页 |
| 1.3.2 Fab表达载体的筛选 | 第38-41页 |
| 1.3.3 DsbA及STII系列表达Fab载体的构建 | 第41-43页 |
| 1.3.4 DsbA及STII系列表达Fab载体的筛选 | 第43-45页 |
| 1.3.5 抗VEGF-Fab的蛋白制备 | 第45-46页 |
| 1.4 讨论 | 第46-47页 |
| 第二章 分子伴侣表达载体的筛选 | 第47-59页 |
| 2.1 材料 | 第48-49页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第48-49页 |
| 2.1.2 引物 | 第49页 |
| 2.1.3 培养基及溶液 | 第49页 |
| 2.1.4 试剂 | 第49页 |
| 2.1.5 分子量标志物 | 第49页 |
| 2.1.6 工具酶 | 第49页 |
| 2.1.7 试剂盒 | 第49页 |
| 2.1.8 生物信息学软件 | 第49页 |
| 2.1.9 统计学分析 | 第49页 |
| 2.1.10 主要仪器和设备 | 第49页 |
| 2.2 方法 | 第49-54页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 | 第49-50页 |
| 2.2.2 质粒的提取 | 第50页 |
| 2.2.3 大肠杆菌基因组的提取 | 第50页 |
| 2.2.4 化学感受态细胞的制备与化学转化法 | 第50页 |
| 2.2.5 构建分子伴侣表达载体 | 第50-53页 |
| 2.2.6 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中的筛选 | 第53-54页 |
| 2.2.6.1 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中的菌株生长特征 | 第53-54页 |
| 2.2.6.2 不同分子伴侣在大肠杆菌DH11T7中Fab的表达差异 | 第54页 |
| 2.3 结果 | 第54-58页 |
| 2.3.1 分子伴侣表达载体的构建 | 第54-56页 |
| 2.3.2 分子伴侣表达载体的筛选 | 第56-58页 |
| 2.4 讨论 | 第58-59页 |
| 第三章 蛋白酶缺陷菌株的构建及发酵工艺 | 第59-77页 |
| 3.1 材料 | 第60-63页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第60-61页 |
| 3.1.2 引物 | 第61页 |
| 3.1.3 培养基及溶液 | 第61-62页 |
| 3.1.4 试剂 | 第62页 |
| 3.1.5 分子量标志物 | 第62页 |
| 3.1.6 工具酶 | 第62页 |
| 3.1.7 试剂盒 | 第62页 |
| 3.1.8 生物信息学软件 | 第62-63页 |
| 3.1.9 统计学分析 | 第63页 |
| 3.1.10 主要仪器和设备 | 第63页 |
| 3.2 方法 | 第63-68页 |
| 3.2.1 琼脂糖凝胶DNA片段的回收 | 第63页 |
| 3.2.2 质粒的提取 | 第63页 |
| 3.2.3 大肠杆菌基因组的提取 | 第63页 |
| 3.2.4 化学感受态细胞的制备与化学转化法 | 第63页 |
| 3.2.5 spr点突变菌株的构建 | 第63-67页 |
| 3.2.5.1 供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB的构建 | 第63-65页 |
| 3.2.5.2 利用供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB实现spr点突变 | 第65-67页 |
| 3.2.6 发酵培养基配方确定 | 第67-68页 |
| 3.2.7 起始培养基中葡萄糖浓度的筛选 | 第68页 |
| 3.2.8 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺 | 第68页 |
| 3.2.9 不同蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺 | 第68页 |
| 3.3 结果 | 第68-75页 |
| 3.3.1 构建spr基因突变的蛋白酶缺陷菌株 | 第68-71页 |
| 3.3.1.1 供体质粒p15AD2IC-Mspr-SacB的构建 | 第68-70页 |
| 3.3.1.2 Cm抗性基因整合鉴定 | 第70页 |
| 3.3.1.3 spr点突变菌株鉴定 | 第70-71页 |
| 3.3.2 发酵培养基摇瓶筛选 | 第71-72页 |
| 3.3.3 起始培养基中初始葡萄糖浓度的确定 | 第72-73页 |
| 3.3.4 蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺 | 第73-74页 |
| 3.3.5 不同蛋白酶缺陷菌株的发酵工艺 | 第74-75页 |
| 3.4 讨论 | 第75-77页 |
| 总结与展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-83页 |
| 附录一: 引物序列 | 第83-86页 |
| 附录二: 信号肽序列 | 第86-87页 |
| 致谢 | 第87-88页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第88页 |
