| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-25页 |
| 1 常用基因编辑技术介绍 | 第14-20页 |
| 1.1 RNA干扰 | 第14-15页 |
| 1.2 ZFN技术 | 第15-16页 |
| 1.3 TALEN技术 | 第16-19页 |
| 1.3.1 TALE蛋白的发现 | 第16页 |
| 1.3.2 TALEN的原理 | 第16-17页 |
| 1.3.3 TALEN的应用 | 第17页 |
| 1.3.4 TALE靶位点的设计 | 第17-19页 |
| 1.3.5 TALEN的构建方法 | 第19页 |
| 1.4 CRISPR/Cas技术 | 第19-20页 |
| 2 RIP家族在细胞死亡调控中的作用 | 第20-24页 |
| 2.1 RIP家族简介 | 第20-21页 |
| 2.2 RIP1的分子结构 | 第21-23页 |
| 2.3 RIP1在程序性细胞死亡中的调控作用 | 第23-24页 |
| 3 人纤维肉瘤HT1080细胞与人乳腺癌MDA-MB-231细胞株 | 第24-25页 |
| 3.1 HT-1080人纤维肉瘤细胞 | 第24页 |
| 3.2 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 | 第24-25页 |
| 第二章 TALEN构建及活性验证体系的建立 | 第25-39页 |
| 1 材料与用品 | 第25-30页 |
| 1.1 实验材料 | 第25页 |
| 1.2 主要仪器 | 第25-26页 |
| 1.3 实验试剂 | 第26-27页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第27-30页 |
| 1.4.1 PBS缓冲液配制 | 第27页 |
| 1.4.2 LB液体培养基的制备 | 第27-28页 |
| 1.4.3 LB液体培养基(含Amp抗生素)(200mL) | 第28页 |
| 1.4.4 LB固体培养基(含Amp抗生素)(200mL) | 第28页 |
| 1.4.5 50×TAE DNA电泳缓冲液(50×储备液) | 第28页 |
| 1.4.6 DMEM培养液配制 | 第28-29页 |
| 1.4.7 卡那霉素储存液配制(50mg/mL) | 第29页 |
| 1.4.8 氨苄青霉素储存液配制(100mg/mL) | 第29页 |
| 1.4.9 0.8%琼脂糖凝胶配制 | 第29页 |
| 1.4.10 1mol/L Tris-HCl(pH8.0) | 第29页 |
| 1.4.11 0.5mol/L EDTA(pH8.0) | 第29页 |
| 1.4.12 HEK293T细胞培养基配制 | 第29-30页 |
| 2 实验方法 | 第30-33页 |
| 2.1 RIP1基因序列分析和靶位点确定 | 第30页 |
| 2.2 设计TALEN的识别序列 | 第30页 |
| 2.3 TALEN构建的操作步骤 | 第30-32页 |
| 2.4 TALEN活性检测步骤 | 第32-33页 |
| 2.4.1 实验准备 | 第32页 |
| 2.4.2 细胞转染操作步骤 | 第32-33页 |
| 3 实验结果 | 第33-37页 |
| 3.1 TALEN识别位点确认 | 第33-34页 |
| 3.2 TALEN构建结果 | 第34-36页 |
| 3.2.1 酶切结果 | 第34-35页 |
| 3.2.2 载体构建结果 | 第35-36页 |
| 3.3 活性检测结果 | 第36-37页 |
| 3.3.1 细胞转染效率检测结果 | 第36-37页 |
| 3.3.2 测序结果 | 第37页 |
| 4 讨论 | 第37-38页 |
| 5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第三章 RIP1敲除的人纤维肉瘤HT108~(RIP1-/-)细胞株构建与筛选 | 第39-54页 |
| 1 材料与用品 | 第39-44页 |
| 1.1 实验材料 | 第39页 |
| 1.2 主要仪器 | 第39-40页 |
| 1.3 实验试剂 | 第40-41页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第41-44页 |
| 2 实验方法 | 第44-49页 |
| 2.1 HT1080细胞的体外传代培养 | 第44-45页 |
| 2.2 细胞转染实验 | 第45页 |
| 2.2.1 实验准备 | 第45页 |
| 2.2.2 细胞转染操作 | 第45页 |
| 2.3 单克隆挑选 | 第45-47页 |
| 2.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞(作为饲养层)提取及铺板 | 第45-46页 |
| 2.3.2 HT1080RIP1-/-细胞株的单克隆筛选及扩增 | 第46-47页 |
| 2.4 HT1080~(RIP1-/-)细胞Western Blot验证 | 第47-49页 |
| 2.4.1 蛋白提取 | 第47-48页 |
| 2.4.2 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第48页 |
| 2.4.3 转膜 | 第48-49页 |
| 2.4.4 蛋白印迹反应 | 第49页 |
| 2.4.5 显色和观察 | 第49页 |
| 3 实验结果 | 第49-52页 |
| 3.1 HT1080细胞的传代培养及形态观察 | 第49-50页 |
| 3.2 HT1080细胞转染效率检测结果 | 第50页 |
| 3.3 HT1080~(RIP1-/-)单克隆筛选结果 | 第50-51页 |
| 3.4 HT1080~(RIP1-/-)构建的测序结果 | 第51-52页 |
| 3.5 HT1080~(RIP1-/-)细胞检测验证结果 | 第52页 |
| 4 讨论 | 第52-53页 |
| 5 本章小结 | 第53-54页 |
| 第四章 RIP1敲除的人乳腺癌MDA-MB-231~(RIP1-/-)细胞株与筛选 | 第54-68页 |
| 1 实验材料和用品 | 第54-59页 |
| 1.1 实验材料 | 第54页 |
| 1.2 主要仪器 | 第54-55页 |
| 1.3 实验试剂 | 第55-56页 |
| 1.4 主要溶液配制 | 第56-59页 |
| 2 实验方法 | 第59-64页 |
| 2.1 人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外传代培养 | 第59页 |
| 2.2 人乳腺癌MDA-MB-231 RIP1-/-细胞株构建 | 第59-60页 |
| 2.2.1 实验准备 | 第59-60页 |
| 2.2.2 操作步骤 | 第60页 |
| 2.3 单克隆挑选 | 第60-62页 |
| 2.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞(作为饲养层)提取及铺板 | 第60-61页 |
| 2.3.2 单克隆样MDA-MB-231RIP1-/-细胞株的扩增 | 第61-62页 |
| 2.4 MDA-MB-231~(RIP1-/-)细胞Western Blot验证 | 第62-64页 |
| 2.4.1 蛋白提取 | 第62页 |
| 2.4.2 SDS-PAGE蛋白电泳 | 第62-63页 |
| 2.4.3 转膜 | 第63页 |
| 2.4.4 蛋白印迹反应 | 第63页 |
| 2.4.5 显色和观察 | 第63-64页 |
| 3 实验结果 | 第64-66页 |
| 3.1 MDA-MB-231细胞的传代培养及形态观察 | 第64页 |
| 3.2 MDA-MB-231细胞转染效率检测结果 | 第64-65页 |
| 3.3 MDA-MB-231~(RIP1-/-)单克隆筛选结果 | 第65页 |
| 3.4 转染后MDA-MB-231~(RIP1-/-)构建结果 | 第65-66页 |
| 3.5 MDA-MB-231~(RIP1-/-)细胞检测验证结果 | 第66页 |
| 4 讨论 | 第66-67页 |
| 5 本章小结 | 第67-68页 |
| 全文总结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-72页 |
| 致谢 | 第72-73页 |
| 个人简历 | 第73页 |
| 在学期间发表的学术论文及专利 | 第73-74页 |
| 附录 | 第74-100页 |
