| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 本论文常用缩写词 | 第7-13页 |
| 1 前言 | 第13-21页 |
| 1.1 流行性乙型脑炎概述 | 第13-20页 |
| 1.1.1 JE流行病学研究 | 第13-15页 |
| 1.1.1.1 JE流行病学国内外的研究状况 | 第13-14页 |
| 1.1.1.2 JEV传染源、传播途径和易感性 | 第14-15页 |
| 1.1.2 JE病原学 | 第15-17页 |
| 1.1.2.1 JEV特征 | 第15页 |
| 1.1.2.2 JEV对细胞和动物敏感性 | 第15页 |
| 1.1.2.3 JEV的理化性质 | 第15-16页 |
| 1.1.2.4 JEV的分子生物学特性 | 第16-17页 |
| 1.1.3 JEV的毒力及致病分子机理 | 第17-18页 |
| 1.1.4 JE的诊断方法 | 第18页 |
| 1.1.5 JE疫苗概况 | 第18-20页 |
| 1.1.5.1 JE鼠脑灭活疫苗 | 第18-19页 |
| 1.1.5.2 原代地鼠肾细胞灭活疫苗 | 第19页 |
| 1.1.5.3 JE弱毒疫苗 | 第19-20页 |
| 1.1.5.4 DNA疫苗 | 第20页 |
| 1.1.5.5 亚单位疫苗 | 第20页 |
| 1.2 本论文研究的目的与意义 | 第20-21页 |
| 2 材料与方法 | 第21-37页 |
| 2.1 材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 菌株、毒株和细胞 | 第21页 |
| 2.1.2 主要酶类及其它相关试剂 | 第21页 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 | 第22页 |
| 2.1.5 实验动物 | 第22-23页 |
| 2.2 方法 | 第23-37页 |
| 2.2.1 Vero细胞的培养及基础细胞库的建立 | 第23-24页 |
| 2.2.1.1 Vero细胞的的复苏 | 第23页 |
| 2.2.1.2 Vero细胞的的传代 | 第23-24页 |
| 2.2.1.3 Vero细胞的的冻存 | 第24页 |
| 2.2.2 JEV/sw/HN-2/2009分离株的纯化 | 第24页 |
| 2.2.3 JEV/sw/GZ/09/2004分离株的纯化 | 第24页 |
| 2.2.4 JEV/sw/GZ/09/2004分离株的增殖培养 | 第24-25页 |
| 2.2.5 病毒细胞半数感染量（TCID50）的测定 | 第25页 |
| 2.2.6 JEV基因组的扩增 | 第25-27页 |
| 2.2.6.1 JEV RT-PCR检测引物的设计与合成 | 第25页 |
| 2.2.6.2 JEV总RNA的抽提 | 第25-26页 |
| 2.2.6.3 反转录反应 | 第26页 |
| 2.2.6.4 JEV E基因PCR扩增 | 第26页 |
| 2.2.6.5 RT-PCR产物的电泳检测 | 第26-27页 |
| 2.2.7 JEV分离株基因组各基因片段的扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.7.1 JEV基因组扩增引物的设计与合成 | 第27页 |
| 2.2.7.2 JEV RNA的抽提 | 第27页 |
| 2.2.7.3 JEV基因组RT-PCR扩增 | 第27-28页 |
| 2.2.7.4 RT-PCR产物的电泳检测 | 第28页 |
| 2.2.8 JEV各基因片段的克隆与鉴定 | 第28-30页 |
| 2.2.8.1 PCR产物的回收与纯化 | 第28-29页 |
| 2.2.8.2 PCR产物连接pMD18-T载体 | 第29页 |
| 2.2.8.3 DH5α 感受态细胞的制备 | 第29页 |
| 2.2.8.4 连接产物转化感受态细胞 | 第29页 |
| 2.2.8.5 质粒DNA的抽提 | 第29-30页 |
| 2.2.8.6 重组质粒的PCR鉴定 | 第30页 |
| 2.2.8.7 各基因片段序列测定及联机检索鉴定 | 第30页 |
| 2.2.9 基因组核苷酸序列及其推导氨基酸序列的分析 | 第30-31页 |
| 2.2.10 全基因、E基因核苷酸序列进化关系分析 | 第31-32页 |
| 2.2.11 JEV/sw/GZ/09/2004培养条件优化 | 第32页 |
| 2.2.11.1 细胞接毒剂量的确定 | 第32页 |
| 2.2.11.2 接毒时细胞密度的确定 | 第32页 |
| 2.2.11.3 病毒接种方式的确定 | 第32页 |
| 2.2.11.4 病毒收获时间的确定 | 第32页 |
| 2.2.12 JEV/sw/GZ/09/2004转瓶繁殖工艺的研究 | 第32-33页 |
| 2.2.12.1 不同接毒量的比较 | 第32-33页 |
| 2.2.12.2 转瓶细胞培养液中血清含量优化 | 第33页 |
| 2.2.12.3 优化前后不同接毒量的比较 | 第33页 |
| 2.2.13 JEV/sw/GZ/09/2004外源病毒检测 | 第33页 |
| 2.2.14 JEV灭活条件优化 | 第33页 |
| 2.2.15 JEV乳化条件优化 | 第33-34页 |
| 2.2.15.1 油相制备 | 第33页 |
| 2.2.15.2 水相制备 | 第33-34页 |
| 2.2.15.3 乳化 | 第34页 |
| 2.2.15.4 病毒乳化工艺的研究 | 第34页 |
| 2.2.16 病毒对小鼠的半数致死量（LD50）的测定 | 第34页 |
| 2.2.17 JEV对本体动物（雄性仔猪）攻毒模型的建立 | 第34-35页 |
| 2.2.18 JEV/sw/GZ/09/2004灭活疫苗免疫效力试验 | 第35页 |
| 2.2.19 猪血清抗体水平检测 | 第35-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-58页 |
| 3.1 JEV分离株基因组序列分析 | 第37-43页 |
| 3.1.1 JEV分离株各基因的RT-PCR扩增 | 第37页 |
| 3.1.2 JEV/sw/HN-2/2009株各基因片段克隆与鉴定 | 第37-39页 |
| 3.1.3 JEV分离株各基因测序结果及序列拼接 | 第39页 |
| 3.1.4 JEV分离株和参考毒株的全基因核苷酸和氨基酸相似性比较 | 第39页 |
| 3.1.5 JEV分离株与疫苗株SA14142 的基因组序列比较 | 第39-41页 |
| 3.1.6 JEV分离株和参考毒株的E基因核苷酸及氨基酸序列相似性分析 | 第41页 |
| 3.1.7 JEV/sw/HN-2/2009株遗传进化关系分析 | 第41-43页 |
| 3.2 JEV/SW/GZ/09/2004培养条件优化 | 第43-48页 |
| 3.2.1 基础细胞库、工作细胞库的建立 | 第43页 |
| 3.2.2 细胞接毒剂量的确定 | 第43-44页 |
| 3.2.3 接毒时细胞密度的确定 | 第44页 |
| 3.2.4 接毒方式的确定 | 第44-45页 |
| 3.2.5 病毒收获时间的确定 | 第45页 |
| 3.2.6 JEV/sw/GZ/09/2004转瓶繁殖工艺的研究 | 第45-48页 |
| 3.2.6.1 不同接毒量的比较 | 第45-46页 |
| 3.2.6.2 转瓶细胞培养液中血清含量优化 | 第46-47页 |
| 3.2.6.3 优化前后不同接毒量的比较 | 第47-48页 |
| 3.3 猪JE疫苗的研制 | 第48-50页 |
| 3.3.1 JEV/sw/GZ/09/2004外源病毒检测 | 第48页 |
| 3.3.2 JEV/sw/GZ/09/2004、JEV-P3病毒半数细胞感染量（TCID50）的测定 | 第48页 |
| 3.3.3 JEV/sw/GZ/09/2004、JEV-P3病毒对小鼠的半数致死量（LD50）的测定 | 第48-49页 |
| 3.3.4 JEV/sw/GZ/09/2004灭活条件的优化 | 第49页 |
| 3.3.5 JEV/sw/GZ/09/2004乳化油配方的优化 | 第49-50页 |
| 3.4 JEV对本体动物（雄性仔猪）攻毒模型的建立 | 第50-55页 |
| 3.4.1 猪JE发病的临床症状 | 第50页 |
| 3.4.2 猪JE肉眼病理变化 | 第50页 |
| 3.4.3 仔猪攻毒前抗原抗体检测及分组 | 第50-51页 |
| 3.4.4 分组仔猪攻毒 | 第51-55页 |
| 3.4.4.1 病毒血症的检测 | 第51-52页 |
| 3.4.4.2 剖解感染仔猪病理变化 | 第52-54页 |
| 3.4.4.3 综合评价 | 第54-55页 |
| 3.5 猪JEV灭活疫苗免疫效力试验 | 第55-58页 |
| 3.5.1 乙脑抗体阴性猪的筛选 | 第55页 |
| 3.5.2 乙脑抗体阴性猪的分组和免疫 | 第55页 |
| 3.5.3 ELISA抗体应答 | 第55-58页 |
| 3.5.3.1 第1组商品化疫苗抗体水平 | 第55-56页 |
| 3.5.3.2 第2组灭活苗JEV/sw/GZ/09/2004 单次免疫组抗体水平 | 第56页 |
| 3.5.3.3 第3组灭活苗JEV/sw/GZ/09/2004 二次免疫组抗体水平 | 第56-57页 |
| 3.5.3.4 第4组空白对照组抗体水平 | 第57-58页 |
| 4 讨论与结论 | 第58-63页 |
| 4.1 JEV分离株基因组序列分析 | 第58-59页 |
| 4.2 JEV分离株的增殖培养 | 第59-60页 |
| 4.3 JE疫苗规模化生产工艺的探索 | 第60-61页 |
| 4.4 JEV攻毒模型的建立 | 第61-62页 |
| 4.5 猪JE灭活疫苗的免疫效力 | 第62-63页 |
| 全文总结 | 第63-65页 |
| 致谢 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 附图 1 JEV/SW/HN-2/2009株全基因组核苷酸序列 | 第71-74页 |
