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褐飞虱体内small RNA的鉴定、利用RNAi技术培育抗褐飞虱水稻及OsATG7基因的功能研究

摘要第1-11页
Abstract第11-15页
名词缩写表第15-16页
第一章 利用RNAi技术培育抗褐飞虱水稻第16-56页
 1 前言第16-26页
   ·褐飞虱取食及生活习性第16页
   ·传统的防治褐飞虱策略简介第16-17页
   ·RNAi的发现与发展第17-19页
     ·反义RNAi第17页
     ·RNAi发展的历史第17-19页
   ·外源dsRNA介导RNAi第19-20页
   ·RNAi技术在植物中的应用研究第20-26页
     ·基因的功能分析第20-21页
     ·在植物抗病害研究中的应用第21页
     ·植物抗虫研究中的应用第21-22页
       ·利用细胞系实验研究RNAi在昆虫中的作用第21页
       ·用喂食或者植物表达dsRNA的方法来研究RNAi在昆虫中的作用第21-22页
     ·基因表达与调控第22-25页
     ·作物品种改良第25-26页
   ·人工外源导入dsRNA或者siRNA诱导RNAi的方式第26页
   ·本研究(RNAi部分)的目的和意义第26页
 2 材料和方法第26-39页
   ·实验材料第26-27页
     ·褐飞虱和水稻材料第26-27页
     ·菌株和载体第27页
   ·实验方法第27-39页
     ·褐飞虱人工饲料的配置和褐飞虱的人工喂食第27-29页
     ·基于T7 RiboMAX Express RNAi System试剂盒的dsRNA合成第29-31页
       ·体外转录模板-带有RNA聚合酶启动子的双链DNA序列第29页
       ·PCR引物及PCR扩增转录模板第29-30页
       ·转录形成dsRNA第30-31页
     ·褐飞虱和水稻RNA的抽提,反转录和qRT-PCR第31-32页
       ·RNA抽提和反转录第31页
       ·qRT-PCR第31-32页
     ·抗褐飞虱RNAi载体(pDS1301)的构建第32页
     ·dsRNA体外喂食褐飞虱的抗褐飞虱鉴定第32-38页
     ·RNAi转基因苗的抗褐飞虱鉴定第38-39页
 3 结果与分析第39-52页
   ·褐飞虱的体外喂食结果第39-48页
     ·摸索dsRNA喂食体系第39-42页
       ·dsRNA的合成第39-40页
       ·dsRNA的降解和喂食方法的确定第40-42页
     ·合成了10条RNA并进行了喂食第42-47页
     ·克隆了全长VE基因,并进行了VE基因dsRNA的精细喂食第47页
     ·提高喂食浓度第47-48页
   ·转基因苗的抗虫鉴定第48-52页
     ·待干涉基因的筛选,载体构建及遗传转化第48页
     ·GST1、PX1、VE三个片段转基因植株的拷贝数检测及表达量分析和苗期和分蘖期抗虫鉴定第48-52页
       ·拷贝数检测,表达量分析和抗虫鉴定第48-52页
       ·GST1、VE、PX1转基因植株喂食褐飞虱后褐飞虱体内相应同源基因的表达量检测结果第52页
 4 讨论第52-56页
   ·利用水稻为介质介导褐飞虱RNAi的思考第52-53页
   ·生物体内RNAi信号的传递第53-55页
   ·关于生物体内siRNA诱导RNAi机制存在的疑问第55-56页
第二章 褐飞虱体内small RNA的鉴定第56-78页
 1 前言第56-62页
   ·dsRNA或者siRNA第56-57页
   ·miRNA第57-58页
   ·piRNA第58-61页
   ·本研究(褐飞虱small RNA鉴定)目的和意义第61-62页
 2 材料与方法第62-65页
   ·实验材料第62页
   ·实验方法第62-65页
     ·褐飞虱small RNA文库的构建及深度测序第62页
     ·small RNA的注释第62页
     ·保守miRNA的鉴定第62页
     ·新miRNA的预测方法第62-63页
     ·miRNA表达量的检测(反转录,RT-PCR,qRT-PCR)第63-65页
       ·miRNA反转录引物和RT-PCR引物第63页
       ·miRNA的反转录、RT-PCR和qRT-PCR第63-65页
 3 结果与分析第65-75页
   ·三种褐飞虱待测序样品的准备第65页
   ·测序结果分析第65-75页
     ·三个文库总small RNA测序结果分析第65-67页
     ·所有small RNA的分类注释第67页
     ·三个文库miRNA的鉴定第67-70页
     ·保守miRNA的碱基偏好性第70页
     ·miRNA表达谱以及在三个文库中的差异第70-72页
     ·保守miRNA与果蝇中已知miRNA的比较第72-73页
     ·新miRNA的鉴定及新的miRNA靶基因的预测第73-75页
     ·比对到重复序列区域的small RNA的分析第75页
     ·miRNA家族进化分析第75页
 4 讨论第75-78页
   ·关于生物体内siRNA和miRNA第75-76页
   ·miRNA的重要性第76-78页
第三章 OsATG7基因的功能研究第78-116页
 1 前言第78-89页
   ·蛋白质,细胞质的降解和自吞噬途径第78-83页
     ·蛋白质,细胞质的转换第78页
     ·自吞噬途径第78-79页
     ·酵母中最早被鉴定的自吞噬分子组分第79-80页
     ·较完整的自吞噬途径相关基因的鉴定第80-83页
   ·自吞噬及自吞噬相关基因在不同物种中的重要作用第83-88页
     ·自吞噬相关基因在老鼠中的作用第85页
     ·自吞噬及其相关基因在果蝇中的作用第85-86页
     ·自吞噬及其相关基因在植物中的作用第86-88页
   ·Atg7在不同物种中的重要作用第88-89页
   ·本研究(OsATG7部分)的目的和意义第89页
 2 材料与方法第89-93页
   ·实验材料第89-90页
     ·水稻材料第89页
     ·菌株和载体第89-90页
   ·实验方法第90-93页
     ·载体的构建第90-92页
     ·水稻原生质体的分离和转化,亚细胞定位分析第92页
     ·OsATG7基因在激素处理后的中花11苗期植株中的表达谱第92页
     ·atg7突变体材料激素含量测定第92页
     ·突变体atg7材料在不同光源条件下胚芽鞘长度测定第92页
     ·OsATG7基因的酵母双杂交筛库实验第92-93页
     ·atg7突变体材料分蘖盛器茎秆石蜡切片实验第93页
     ·atg7突变体材料叶绿素含量测定第93页
 3 结果与分析第93-106页
   ·atg7突变体的共分离检测第93-94页
   ·atg7纯合突变体植株株高变矮,茎秆变细第94-95页
   ·atg7纯合突变体材料不育第95-96页
   ·atg7突变体材料在N缺乏条件下的生长差异第96-97页
   ·OsATG7基因的功能探索第97-98页
   ·OsATG7基因编码蛋白的亚细胞定位情况第98-99页
   ·OsATG7基因在不同激素处理后的野生型中花11中的表达谱第99-100页
   ·atg7突变体材料中各激素含量的差异第100-101页
   ·atg7突变体材料在红光、黑暗、白光条件下生长胚芽鞘长度的差异第101-102页
   ·JA信号转导途径相关基因在atg7突变体材料中的表达情况第102-103页
   ·OsATG7基因编码蛋白的酵母双杂交实验第103-104页
   ·atg7突变体材料透射电镜结果第104-106页
 4 讨论第106-107页
 5 参考文献第107-116页
附录A protocol第116-126页
附录B 个人简历第126-128页
致谢第128页

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