| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-9页 |
| 第一章 绪论 | 第9-15页 |
| ·角质酶的概述 | 第9-10页 |
| ·角质酶的结构与功能 | 第9-10页 |
| ·角质酶的制备 | 第10页 |
| ·大肠杆菌表达分泌重组蛋白的概述 | 第10-12页 |
| ·大肠杆菌表达系统的介绍 | 第10-11页 |
| ·大肠杆菌主要分泌途径概述 | 第11-12页 |
| ·立题依据及意义 | 第12-13页 |
| ·主要研究内容 | 第13-15页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第15-25页 |
| ·菌株与载体 | 第15页 |
| ·试剂与仪器 | 第15-16页 |
| ·主要试剂 | 第15-16页 |
| ·主要仪器 | 第16页 |
| ·培养方法 | 第16-17页 |
| ·培养基 | 第16-17页 |
| ·种子活化培养 | 第17页 |
| ·摇瓶发酵培养 | 第17页 |
| ·分子操作 | 第17-23页 |
| ·大肠杆菌感受态制作方法 | 第17-18页 |
| ·大肠杆菌基因组上的基因敲除 | 第18-19页 |
| ·引物设计 | 第19页 |
| ·基因敲除涉及的引物 | 第19页 |
| ·其他载体构建涉及的引物 | 第19页 |
| ·基本分子操作流程 | 第19-22页 |
| ·质粒的提取 | 第20页 |
| ·PCR 反应 | 第20页 |
| ·基因片段的胶回收 | 第20-21页 |
| ·限制性内切酶酶切体系 | 第21页 |
| ·基因与载体的连接 | 第21-22页 |
| ·化学转化与电转化 | 第22页 |
| ·重组载体的构建 | 第22-23页 |
| ·分析检测方法 | 第23-25页 |
| ·菌浓的检测 | 第23页 |
| ·角质酶酶活的测定 | 第23页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳（SDS-PAGE） | 第23-25页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第25-45页 |
| ·外膜渗漏型菌株的构建及其分泌能力研究 | 第25-30页 |
| ·外膜脂蛋白基因lpp 的敲除 | 第25-27页 |
| ·大肠杆菌BL21 Star（DE3）基因组的提取 | 第25-26页 |
| ·同源臂的设计及抗性基因的获得 | 第26页 |
| ·目的片段在基因组上的重组及转化子的验证 | 第26-27页 |
| ·lpp 膜脂蛋白基因敲除对重组角质酶胞外分泌的影响 | 第27-30页 |
| ·跨内膜转运强化探究 | 第30-33页 |
| ·伴侣蛋白SecA 的共表达 | 第30-32页 |
| ·伴侣蛋白SecM-SecA 的共表达 | 第32-33页 |
| ·低合成强度下的分泌强化探索 | 第33-39页 |
| ·低合成强度的获得—TIR 简并性突变技术与角质酶快速筛选技术的建立 | 第34-38页 |
| ·角质酶产生菌快速筛选方法的建立 | 第34-35页 |
| ·重组质粒pTRC99A /cutinase0883 的构建 | 第35-36页 |
| ·TIR 突变文库的初步建立 | 第36-37页 |
| ·低合成强度表达载体的获得 | 第37-38页 |
| ·低合成强度下外膜渗漏菌株的发酵初探 | 第38-39页 |
| ·低合成强度下lpp 外膜脂蛋白基因敲除菌的发酵培养条件优化 | 第39-45页 |
| ·铁离子与硝酸根离子对发酵产酶的影响 | 第39-41页 |
| ·其他化学添加剂的作用 | 第41-45页 |
| 第四章 结论与展望 | 第45-47页 |
| ·结论 | 第45-46页 |
| ·展望 | 第46-47页 |
| 致谢 | 第47-49页 |
| 参考文献 | 第49-53页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第53页 |
