| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-17页 |
| 缩略语的中英文对照 | 第17-18页 |
| 引言 | 第18-21页 |
| 参考文献 | 第19-21页 |
| 第一部分 文献综述 | 第21-72页 |
| 第一章 哺乳动物克隆研究进展 | 第21-41页 |
| 1.不同类型的克隆 | 第22-26页 |
| ·自然克隆 | 第22页 |
| ·胚胎分割 | 第22-23页 |
| ·胚胎细胞克隆 | 第23-24页 |
| ·体细胞核移植(SCNT) | 第24-26页 |
| ·体细胞核移植(SCNT)标准方案 | 第24-25页 |
| ·徒手克隆(Handmade cloning,HMC) | 第25-26页 |
| 2.体细胞核移植(SCNT)后的发育 | 第26-29页 |
| ·发育异常 | 第26-28页 |
| ·实验方法和技术对发育的影响 | 第28-29页 |
| ·克隆动物及其后代的发育 | 第29页 |
| 3.动物克隆的应用 | 第29-34页 |
| ·生物医学应用 | 第30-33页 |
| ·疾病模型 | 第30-31页 |
| ·治疗性克隆 | 第31页 |
| ·生物反应器 | 第31-32页 |
| ·异种移植 | 第32-33页 |
| ·农业应用 | 第33-34页 |
| 参考文献 | 第34-41页 |
| 第二章 体细胞核移植(SCNT)与核重序 | 第41-58页 |
| 1.体细胞核移植与核重序的关系 | 第42页 |
| 2.端粒与端粒酶 | 第42-44页 |
| 3.体细胞核移植与线粒体 | 第44-45页 |
| 4.体细胞克隆表观遗传学变化 | 第45-49页 |
| ·体细胞核移植与DNA甲基化 | 第45-46页 |
| ·体细胞核移植与基因组印迹 | 第46-47页 |
| ·体细胞核移植与X染色体失活 | 第47-48页 |
| ·体细胞核移植与组蛋白修饰及染色体重塑 | 第48-49页 |
| 5.体细胞核移植与基因表达 | 第49-50页 |
| 6.展望 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-58页 |
| 第三章 DNA甲基化及其检测方法研究进展 | 第58-72页 |
| 1.甲基化与CPG岛 | 第58-59页 |
| 2.DNA甲基化的研究方法 | 第59-61页 |
| ·甲基化敏感限制酶方法 | 第59-60页 |
| ·限制性酶及PCR的方法 | 第60页 |
| ·基因测序的方法 | 第60页 |
| ·亚硫酸氢盐处理的方法 | 第60-61页 |
| ·其他甲基化分析方法 | 第61页 |
| 3.DNA甲基化与组蛋白乙酰化的关系 | 第61-62页 |
| 4.DNA甲基化的功能与作用 | 第62-68页 |
| ·DNA甲基化与基因表达 | 第62-64页 |
| ·DNA甲基化与生长发育 | 第64页 |
| ·DNA甲基化与X染色体失活 | 第64-65页 |
| ·DNA甲基化与基因印迹 | 第65-66页 |
| ·DNA甲基化与细胞衰老的关系 | 第66-67页 |
| ·DNA甲基化与肿瘤 | 第67页 |
| ·DNA甲基化与转基因 | 第67-68页 |
| ·DNA甲基化与哺乳动物克隆 | 第68页 |
| 5.问题与展望 | 第68页 |
| 参考文献 | 第68-72页 |
| 第二部分 实验研究 | 第72-148页 |
| 第四章 山羊印迹基因H19和IGF2R差异甲基化区域(DMR)的克隆测序及生物信息学分析 | 第72-90页 |
| 1.材料与方法 | 第73-80页 |
| ·实验动物 | 第73页 |
| ·山羊血液基因组DNA的提取 | 第73-74页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶制备 | 第74页 |
| ·银染 | 第74-75页 |
| ·引物设计 | 第75-76页 |
| ·H19上游调控区引物设计 | 第75页 |
| ·IGF2R基因第二内含子DMR_2引物设计 | 第75-76页 |
| ·H19和IGF2R差异甲基化区域的扩增 | 第76-77页 |
| ·将目的片段连接到pGEM(?)-T Easy Vector上(TA克隆) | 第77-80页 |
| ·PCR产物与pGEM(?)-T Easy Vector连接反应 | 第77-78页 |
| ·JM109感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第78页 |
| ·转化 | 第78-79页 |
| ·质粒DNA的提取(碱裂解法) | 第79-80页 |
| ·序列的拼接与生物信息学分析 | 第80页 |
| 2.结果与分析 | 第80-87页 |
| ·目标片段的获得 | 第80-81页 |
| ·片段的拼接 | 第81-87页 |
| ·H19上游调控区域拼接结果 | 第81-83页 |
| ·IGF2R第二内含子DMR测序与拼接 | 第83-84页 |
| ·山羊H19上游调控区和IGF2R内含子2DMR的CpG岛分析结果 | 第84-86页 |
| ·H19基因上游调控区CTCF结合部位与其他动物比较 | 第86页 |
| ·H19基因上游调控区和IGF2R第二内含子DMR序列的进化分析 | 第86-87页 |
| 3.讨论 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-90页 |
| 第五章 体细胞克隆山羊H19和IGF2R基因差异甲基化区域(DMR)甲基化状况分析 | 第90-106页 |
| 1.材料与方法 | 第91-99页 |
| ·样品采集 | 第91页 |
| ·试剂和仪器准备 | 第91-92页 |
| ·组织样品DNA的提取 | 第92-93页 |
| ·甲基化检测方法 | 第93-94页 |
| ·酶切体系 | 第94页 |
| ·酶切后DNA的浓缩 | 第94页 |
| ·Southern杂交 | 第94-99页 |
| ·DNA探针的标记 | 第94-95页 |
| ·DNA探针标记效率检测 | 第95-96页 |
| ·DNA的电泳与Southern转移 | 第96-97页 |
| ·预杂交和杂交 | 第97-98页 |
| ·免疫学检测 | 第98页 |
| ·探针洗脱与DNA印迹重新探测 | 第98页 |
| ·分子量标记印迹显示 | 第98-99页 |
| ·数据处理与统计 | 第99页 |
| 2.结果与分析 | 第99-103页 |
| ·探针标记效率 | 第99页 |
| ·H19基因上游差异甲基化区域(DMR)甲基化状况 | 第99-101页 |
| ·IGF2R基因内含子差异甲基化区域(DMR)甲基化状况 | 第101-103页 |
| 3.讨论 | 第103-104页 |
| 参考文献 | 第104-106页 |
| 第六章 体细胞克隆山羊小卫星DNA重复序列甲基化分析 | 第106-114页 |
| 1.材料与方法 | 第107-108页 |
| ·样品采集 | 第107页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第107页 |
| ·组织样品DNA的提取 | 第107页 |
| ·小卫星DNA甲基化检测方法及原理 | 第107-108页 |
| ·酶切体系 | 第107-108页 |
| ·酶切后DNA的浓缩 | 第108页 |
| ·Southern杂交 | 第108页 |
| ·人源小卫星DNA探针33.6的合成与标记 | 第108页 |
| ·数据处理与统计 | 第108页 |
| 2 结果与分析 | 第108-111页 |
| ·探针标记效率 | 第108-109页 |
| ·成年克隆山羊小卫星DNA片段甲基化程度 | 第109-111页 |
| 3 讨论 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-114页 |
| 第七章 体细胞克隆山羊端粒长度分析 | 第114-123页 |
| 1.材料与方法 | 第115-116页 |
| ·样品采集 | 第115页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第115页 |
| ·组织样品DNA的提取 | 第115页 |
| ·端粒检测方法及原理 | 第115-116页 |
| ·酶切体系 | 第115-116页 |
| ·酶切后DNA的浓缩 | 第116页 |
| ·Southern杂交 | 第116页 |
| ·端粒DNA探针的合成与标记 | 第116页 |
| ·端粒DNA探针标记效率检测 | 第116页 |
| ·端粒长度的计算 | 第116页 |
| ·数据分析 | 第116页 |
| 2.结果与分析 | 第116-119页 |
| ·端粒探针标记效率检测 | 第116-117页 |
| ·成年克隆山羊端粒长度检测结果 | 第117-119页 |
| ·克隆山羊个体与继代克隆山羊个体端粒长度与其供核体端粒长度比较 | 第119页 |
| 3.讨论 | 第119-120页 |
| 参考文献 | 第120-123页 |
| 第八章 体细胞克隆山羊印迹基因H19、IGF2和IGF2R的克隆与表达分析 | 第123-137页 |
| 1.材料与方法 | 第123-127页 |
| ·样品采集 | 第123-124页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第124页 |
| ·RNA提取及质量检测 | 第124页 |
| ·反转录 | 第124页 |
| ·引物设计与合成 | 第124-125页 |
| ·PCR反应 | 第125页 |
| ·IGF2基因的3'RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends) | 第125-126页 |
| ·PCR产物回收及克隆测序 | 第126页 |
| ·序列的确认与生物信息学分析 | 第126页 |
| ·荧光实时定量PCR | 第126页 |
| ·Real-time PCR产物单链构象多态性(SSCP) | 第126页 |
| ·数据分析 | 第126-127页 |
| 2.结果与分析 | 第127-132页 |
| ·RNA、cDNA和RACE cDNA质量鉴定 | 第127页 |
| ·山羊H19、IGF2和IGF2R基因cDNA的测序及生物信息学分析 | 第127-130页 |
| ·克隆山羊生长发育相关印迹基因的表达 | 第130-131页 |
| ·不同细胞类型来源克隆山羊生长发育相关印迹基因的表达 | 第131-132页 |
| ·克隆山羊H19和IGF2基因单等位表达方式分析 | 第132页 |
| 3.讨论 | 第132-133页 |
| 参考文献 | 第133-137页 |
| 第九章 体细胞克隆山羊非印迹基因IGF1、IGF1R、GHR和GHSR的克隆与表达分析 | 第137-148页 |
| 1.材料与方法 | 第138-140页 |
| ·样品采集 | 第138页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第138页 |
| ·RNA提取及质量检测 | 第138页 |
| ·反转录 | 第138-139页 |
| ·引物设计与合成 | 第139页 |
| ·PCR反应 | 第139页 |
| ·PCR产物回收及克隆测序 | 第139页 |
| ·序列的确认与生物信息学分析 | 第139页 |
| ·荧光实时定量PCR | 第139-140页 |
| ·数据分析 | 第140页 |
| 2.结果与分析 | 第140-145页 |
| ·IGF1、IGF1R、GHR和GHSR基因的RT-PCR扩增和克隆质粒测序结果 | 第140-141页 |
| ·IGF1R、GHR和GHSR基因序列的确认与生物信息学分析 | 第141-143页 |
| ·克隆山羊生长发育相关非印迹基因的表达 | 第143-144页 |
| ·不同细胞类型来源克隆山羊生长发育相关非印迹基因的表达 | 第144-145页 |
| 3.讨论 | 第145-146页 |
| 参考文献 | 第146-148页 |
| 总体讨论 | 第148-155页 |
| 1.体细胞克隆山羊甲基化状况 | 第148-149页 |
| 2.体细胞克隆山羊端粒长度 | 第149-150页 |
| 3.体细胞克隆山羊生长相关基因的表达 | 第150-152页 |
| 参考文献 | 第152-155页 |
| 全文结论 | 第155-156页 |
| 全文创新 | 第156-157页 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 | 第157-158页 |
| 致谢 | 第158页 |
