| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4-5页 |
| 主要英文缩略词对照表 | 第10-11页 |
| 第1章 前言 | 第11-29页 |
| 1.1 自噬研究简介 | 第11-23页 |
| 1.1.1 自噬的研究历史 | 第11-12页 |
| 1.1.2 自噬的分类和基本过程 | 第12-15页 |
| 1.1.3 自噬的核心分子机制 | 第15-21页 |
| 1.1.4 自噬的信号调节通路 | 第21-23页 |
| 1.2 ATG2-ATG18/WIPI复合体的研究现状 | 第23-27页 |
| 1.2.1 ATG2家族蛋白的研究现状 | 第23-24页 |
| 1.2.2 ATG18/PROPPIN/WIPI家族蛋白的研究现状 | 第24-27页 |
| 1.3 立题依据 | 第27-29页 |
| 第2章 实验材料与方法 | 第29-55页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-38页 |
| 2.1.1 菌株与细胞株 | 第29页 |
| 2.1.2 目的基因、引物与质粒 | 第29-32页 |
| 2.1.3 分子、生化试剂与抗体 | 第32-34页 |
| 2.1.4 主要溶液与培养基配方 | 第34-37页 |
| 2.1.5 实验仪器 | 第37-38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-55页 |
| 2.2.1 目的基因表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2 目的基因的定点突变 | 第39-40页 |
| 2.2.3 细胞传代培养、药物处理与冻存 | 第40-42页 |
| 2.2.4 细胞的电转化与化学转化 | 第42-43页 |
| 2.2.5 稳定转染细胞系的构建 | 第43页 |
| 2.2.6 Cas9敲除细胞系的构建 | 第43-46页 |
| 2.2.7 贴壁细胞的免疫荧光染色 | 第46-47页 |
| 2.2.8 电子显微镜样品的准备 | 第47-48页 |
| 2.2.9 免疫印迹(Western-blotting)实验 | 第48-49页 |
| 2.2.10 生物素-链霉亲和素共沉淀(Strep-Tactin pull-down)实验 | 第49-50页 |
| 2.2.11 蛋白的大量表达与纯化 | 第50页 |
| 2.2.12 脂质体相关实验 | 第50-53页 |
| 2.2.13 蛋白复合体的体外交联实验 | 第53页 |
| 2.2.14 蛋白的体外荧光标记实验 | 第53页 |
| 2.2.15 生物信息学分析软件与数据库 | 第53-55页 |
| 第3章 ATG2家族、WIPI家族同源蛋白的比较 | 第55-63页 |
| 3.1 引言 | 第55页 |
| 3.2 实验结果 | 第55-61页 |
| 3.2.1 ATG2家族蛋白、WIPI家族蛋白的同源性分析 | 第55-58页 |
| 3.2.2 ATG2家族蛋白、WIPI家族蛋白的亚细胞定位分析 | 第58-60页 |
| 3.2.3 ATG2家族蛋白与WIPI家族蛋白的互作能力分析 | 第60-61页 |
| 3.3 讨论与小结 | 第61-63页 |
| 第4章 ATG2B-WDR45复合体的大量表达与纯化 | 第63-70页 |
| 4.1 引言 | 第63页 |
| 4.2 实验结果 | 第63-69页 |
| 4.2.1 蛋白的HEK293表达体系与链霉亲和素纯化系统的建立 | 第63-64页 |
| 4.2.2 ATG2B-WDR45蛋白复合体表达条件的优化 | 第64-67页 |
| 4.2.3 ATG2B-WDR45复合体的大量表达、纯化和性质分析 | 第67-69页 |
| 4.3 讨论与小结 | 第69-70页 |
| 第5章 ATG2B-WDR45复合体结合位点的鉴定与功能验证 | 第70-87页 |
| 5.1 引言 | 第70页 |
| 5.2 实验结果 | 第70-85页 |
| 5.2.1 ATG2B-WDR45复合体的交联质谱分析 | 第70-76页 |
| 5.2.2 WDR45蛋白上ATG2B结合位点的鉴定 | 第76-79页 |
| 5.2.3 ATG2B蛋白上WDR45结合Y/HF基序的鉴定和保守性分析 | 第79-82页 |
| 5.2.4 ATG2B-WDR45复合体结合Y/HF基序的功能验证 | 第82-85页 |
| 5.3 讨论与小结 | 第85-87页 |
| 第6章 ATG2B-WDR45复合体的膜结合能力分析 | 第87-100页 |
| 6.1 引言 | 第87页 |
| 6.2 实验结果 | 第87-98页 |
| 6.2.1 蛋白的Lipid Strip脂结合实验 | 第87-88页 |
| 6.2.2 蛋白-脂质体沉淀(sedimentation)实验 | 第88-90页 |
| 6.2.3 蛋白-脂质体漂浮(floatation)实验 | 第90-92页 |
| 6.2.4 蛋白-脂质体的负染电子显微镜成像 | 第92-93页 |
| 6.2.5 ATG2B-WDR45复合体脂滴结合能力的探究 | 第93-95页 |
| 6.2.6 ATG2B-WDR45复合体的脂质体锚定(tethering)实验 | 第95-98页 |
| 6.3 讨论与小结 | 第98-100页 |
| 第7章 ATG2B-WDR45复合体的负染电镜结构解析 | 第100-109页 |
| 7.1 引言 | 第100页 |
| 7.2 实验结果 | 第100-107页 |
| 7.2.1 ATG2B、ATG2B-WDR45复合体的二维分类 | 第100-103页 |
| 7.2.2 ATG2B-WDR45复合体的三维重构 | 第103-104页 |
| 7.2.3 ATG2B-WDR45复合体的N端C端分析 | 第104-106页 |
| 7.2.4 ATG2B-WDR45复合体与WDR45的分子对接(molecular docking) | 第106-107页 |
| 7.3 讨论与小结 | 第107-109页 |
| 第8章 ATG2-WIPI复合体家族参与自噬形成机制的探索 | 第109-123页 |
| 8.1 引言 | 第109页 |
| 8.2 实验结果 | 第109-122页 |
| 8.2.1 Atg2家族、Wipi家族基因敲除细胞系的建立 | 第109-111页 |
| 8.2.2 Atg2家族、Wipi家族基因敲除细胞系的自噬水平检测 | 第111-116页 |
| 8.2.3 Atg2家族基因敲除细胞系自噬表型的深入比较 | 第116-119页 |
| 8.2.4 Atg2a&Atg2b双敲除细胞系中特殊细胞结构的探究 | 第119-122页 |
| 8.3 讨论与小结 | 第122-123页 |
| 第9章 总结与展望 | 第123-132页 |
| 9.1 论文总结 | 第123-126页 |
| 9.2 问题与讨论 | 第126-130页 |
| 9.2.1 ATG2-WIPI复合体家族不同成员之间的互作模式探讨 | 第126页 |
| 9.2.2 ATG2蛋白、ATG2-WIPI复合体与膜互作的特异性与选择性 | 第126-127页 |
| 9.2.3 ATG2-WIPI复合体促进脂质体聚集实验的分析 | 第127-128页 |
| 9.2.4 哺乳动物ATG2家族、WIPI家族蛋白参与自噬体形成的可能模型 | 第128-130页 |
| 9.3 论文展望 | 第130-132页 |
| 参考文献 | 第132-150页 |
| 致谢 | 第150-153页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第153页 |
