| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 缩略词和术语表 | 第12-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-35页 |
| 1.1 链霉菌次级代谢产物合成途径 | 第17-22页 |
| 1.1.1 PKS | 第17-19页 |
| 1.1.2 NRPS | 第19-20页 |
| 1.1.3 杂合的PKS-NRPS | 第20页 |
| 1.1.4 FK506的生物合成途径 | 第20-22页 |
| 1.2 Ⅰ型PKS中AT结构和转移底物的多样性 | 第22-29页 |
| 1.2.1 PKS中AT的结构多样性 | 第23-24页 |
| 1.2.2 Ⅰ型AT结构域转移底物的多样性 | 第24-26页 |
| 1.2.3 AT的结构域的催化机制决定底物专一性 | 第26-27页 |
| 1.2.4 AT的结构决定底物专一性 | 第27-29页 |
| 1.3 Ⅰ型AT结构域的基因工程改造 | 第29-34页 |
| 1.3.1 AT结构域的替换在新聚酮化合物合成中的应用 | 第30-32页 |
| 1.3.2 AT点突变在新聚酮化合物合成中的应用 | 第32-33页 |
| 1.3.3 Trans-AT互补在新聚酮化合物合成中的应用 | 第33-34页 |
| 1.4 本课题的研究目的与意义 | 第34-35页 |
| 第二章 酰基转移酶AT4_(FKBB)引入罕见酰基AM和特殊酰基EM的机制研究 | 第35-79页 |
| 2.1 实验材料 | 第36-40页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第36页 |
| 2.1.2 试剂 | 第36-37页 |
| 2.1.3 主要溶液和培养基的配置 | 第37-40页 |
| 2.1.4 实验仪器和设备 | 第40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-52页 |
| 2.2.1 ATs及其各自突变体和ACPs的异源表达载体构建 | 第40-43页 |
| 2.2.2 ATs及其各自突变体和ACPs的异源表达和纯化 | 第43-44页 |
| 2.2.3 ATs及其各自突变体的圆二色谱实验 | 第44页 |
| 2.2.4 ATs,ACPs和不同酰基的自酰化和转酰化反应 | 第44-45页 |
| 2.2.5 FK506 PKS的AT4_(FkbB)和特异性转移酰基EM的其他PKS中的酰基转移酶所构建的进化树 | 第45-46页 |
| 2.2.6 AM/EM-[KS4][AT4]_(FkbB)和[KS4][AT4]_(FkbB)-ACP4_(FkbB)的对接模型和MDs | 第46页 |
| 2.2.7 AT4_(FkbB)及其突变体与ACP4_(FkbB)的交联反应及复合体AT4_(FkbB)ACP4_(FkbB)的纯化 | 第46-47页 |
| 2.2.8 筑波链霉菌L19基因组的人工染色体(PAC)文库的建立 | 第47-48页 |
| 2.2.9 FK506 PKS中AT4_(FkbB)点突变体V187K的构建 | 第48-52页 |
| 2.2.10 筑波链霉菌L19的发酵及发酵产物FK506和FK520的效价测定 | 第52页 |
| 2.3 实验结果 | 第52-74页 |
| 2.3.1 FK506合成基因簇序列的分析 | 第52-53页 |
| 2.3.2 蛋白AT4_(FkbB),ACP4_(FkbB)和ACP_(TcsA)的表达及其基本功能研究 | 第53-54页 |
| 2.3.3 AT4_(FkbB)转移ACP_(TcsA)和CoA携带的酰基AM到ACP4_(FkbB)上 | 第54-56页 |
| 2.3.4 AT4_(FkbB)催化ACP_(TcsA)携带的AM转移到ACP4_(FkbB)的反应是可逆的 | 第56-58页 |
| 2.3.5 AT4_(FkbB)转移CoA携带的EM而非MM和M到ACP4_(FkbB)上 | 第58页 |
| 2.3.6 AT4_(FkbB)在自酰化反应中识别AM,EM和MM不识别M | 第58-61页 |
| 2.3.7 AT4_(FkbB)对酰基载体蛋白的选择性 | 第61页 |
| 2.3.8 AT4_(FkbB)对AM/EM-CoA的竞争性识别和转移 | 第61-65页 |
| 2.3.9 Gln119,Leu185-Val186-Val187和Phe203在AT4_(FkbB)特异性转移酰基AM的过程中起重要作用 | 第65-67页 |
| 2.3.10 根据对接模型分析Gln119,Leu185-Val186-Val187和Phe203在AT4_(FkbB)的酰基特异性转移酰基AM中所起的重要作用 | 第67-68页 |
| 2.3.11 通过特异性识别EM ATs中关键位点可增强酰基AM的转移 | 第68-70页 |
| 2.3.12 V187K增强AT4_(FkbB)对酰基AM的识别性 | 第70-74页 |
| 2.4 讨论 | 第74-78页 |
| 2.4.1 AT4_(FkbB)作为研究特异性上载AM单元的最佳研究对象 | 第74页 |
| 2.4.2 ACP和CoA可作为酰基载体 | 第74-75页 |
| 2.4.3 AT在自酰化和转酰化中的底物选择性 | 第75-76页 |
| 2.4.4 关键氨基酸位点对AT的底物选择性起关键作用 | 第76-77页 |
| 2.4.5 F203L在AT4_(FkbB)中特异性转移酰基AM的可能作用 | 第77页 |
| 2.4.6 AT特异性识别底物的关键位点突变可改变其转移的酰基 | 第77-78页 |
| 2.5 小结 | 第78-79页 |
| 第三章 酰基转移酶AT8_(FKBA)引入特殊酰基MEO的机制研究 | 第79-106页 |
| 3.1 实验材料 | 第79-81页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第79-80页 |
| 3.1.2 试剂 | 第80-81页 |
| 3.1.3 主要溶液和培养基的配制 | 第81页 |
| 3.1.4 实验仪器和设备 | 第81页 |
| 3.2 实验方法 | 第81-85页 |
| 3.2.1 ATs及其各自突变体和ACPs的载体构建,异源表达,纯化和圆二色谱实验 | 第81-82页 |
| 3.2.2 ATs与ACPs、酰基的体外生化反应 | 第82页 |
| 3.2.3 FK506 PKS的AT7_(FkbA),AT8_(FkbA)和特异性转移酰基MeO的其他PKS中的酰基转移酶所构建的进化树 | 第82页 |
| 3.2.4 [KS8][AT8]FkbA和MeO,ACP8_(FkbA)的对接模型和MDs | 第82-84页 |
| 3.2.5 FK506 PKS中AT10_(FkbA)原位点突变体的构建 | 第84-85页 |
| 3.2.6 筑波链霉菌L19的发酵及其发酵产物的测定和结构分析 | 第85页 |
| 3.3 实验结果 | 第85-100页 |
| 3.3.1 AT7_(FkbA)和AT8_(FkbA)分别引入特殊酰基MeO到相应ACP7_(FkbA)和ACP8_(FkbA)上 | 第85-88页 |
| 3.3.2 AT8_(FkbA)在自酰化反应中特异性识别ACP_(FkbJ)和CoA携带的MeO转移到ACPs上 | 第88-90页 |
| 3.3.3 AT8_(FkbA)特异性转移酰基MeO的关键氨基酸 | 第90-96页 |
| 3.3.4 突变AT10_(FkbA)的氨基酸位点为AT8_(FkbA)上影响与酰基MeO结合的氨基酸位点可改变其酰基的选择性 | 第96-100页 |
| 3.4 讨论 | 第100-104页 |
| 3.4.1 FK506 PKS中AT7_(FkbA)和AT8_(FkbA)作为研究特异性转移酰基MeO的研究对象 | 第100-102页 |
| 3.4.2 ATs对酰基的特异性选择对聚酮化合物主链的高效合成起关键作用 | 第102-103页 |
| 3.4.3 ATs的关键氨基酸位点在对酰基的特异性选择中起重要作用 | 第103页 |
| 3.4.4 突变AT识别底物的关键氨基酸可改变其转移的酰基 | 第103-104页 |
| 3.5 小结 | 第104-106页 |
| 第四章 总结和展望 | 第106-108页 |
| 4.1 总结 | 第106-107页 |
| 4.2 展望 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-119页 |
| 附录 | 第119-132页 |
| 在学期间所取得的科研成果 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133页 |
