| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-19页 |
| 1.1 纤维素乙醇概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 木质纤维素 | 第10页 |
| 1.1.2 生物乙醇研究状况 | 第10页 |
| 1.1.3 纤维素乙醇研究状况 | 第10-12页 |
| 1.1.3.1 国内外纤维素乙醇生产状况 | 第11页 |
| 1.1.3.2 微生物产纤维素乙醇研究状况 | 第11-12页 |
| 1.2 纤维素乙醇水解发酵工艺 | 第12-16页 |
| 1.2.1 分别水解发酵(SHF) | 第14页 |
| 1.2.2 分别水解共发酵(SHCF) | 第14页 |
| 1.2.3 同步糖化发酵(SSF) | 第14页 |
| 1.2.4 统合生物加工(CBP) | 第14-16页 |
| 1.3 乙醇耐受性及其意义 | 第16-18页 |
| 1.3.1 乙醇对微生物的影响 | 第16-17页 |
| 1.3.2 乙醇对酶的影响 | 第17页 |
| 1.3.3 乙醇耐受机制 | 第17-18页 |
| 1.3.4 耐乙醇纤维素酶的意义 | 第18页 |
| 1.4 研究目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二章 耐乙醇纤维素酶的筛选 | 第19-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第19页 |
| 2.1.1 样品 | 第19页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第19页 |
| 2.1.3 仪器与设备 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-24页 |
| 2.2.1 耐乙醇产纤维素酶菌株的分离筛选 | 第19-22页 |
| 2.2.1.1 培养基的配制 | 第19-20页 |
| 2.2.1.2 酒厂土壤样品的分离 | 第20页 |
| 2.2.1.3 菌株的纯化保藏 | 第20页 |
| 2.2.1.4 16S rRNA基因测序鉴定 | 第20-21页 |
| 2.2.1.5 候选菌株的确定 | 第21-22页 |
| 2.2.2 候选菌株纤维素酶基因的克隆表达 | 第22-24页 |
| 2.2.2.1 引物设计 | 第22页 |
| 2.2.2.2 PCR扩增候选菌株纤维素酶基因 | 第22-23页 |
| 2.2.2.3 纤维素酶基因的克隆 | 第23页 |
| 2.2.2.4 纤维素酶的初步表达 | 第23页 |
| 2.2.2.5 粗酶液乙醇耐受度检测 | 第23-24页 |
| 2.3 实验结果 | 第24-28页 |
| 2.3.1 土壤样品的分离筛选 | 第24页 |
| 2.3.2 分离菌株多样性分析 | 第24-26页 |
| 2.3.3 候选菌株信息 | 第26页 |
| 2.3.4 候选菌株纤维素酶基因PCR | 第26-27页 |
| 2.3.5 纤维素酶基因序列分析 | 第27页 |
| 2.3.6 粗酶液乙醇耐受性 | 第27-28页 |
| 2.4 小结与讨论 | 第28-30页 |
| 第三章 耐乙醇纤维素酶ThCel6A的原核表达及性质研究 | 第30-42页 |
| 3.1 实验材料 | 第30页 |
| 3.1.1 实验菌株 | 第30页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第30页 |
| 3.1.3 主要仪器设备 | 第30页 |
| 3.2 实验方法 | 第30-33页 |
| 3.2.1 原核表达载体pET28a-ThCel6A的构建 | 第30-31页 |
| 3.2.1.1 ThCel6A基因的扩增 | 第30页 |
| 3.2.1.2 pET28a-ThCel6A载体构建 | 第30-31页 |
| 3.2.1.3 重组质粒转化E.coli | 第31页 |
| 3.2.2 重组ThCel6A的表达纯化 | 第31页 |
| 3.2.2.1 IPTG诱导表达 | 第31页 |
| 3.2.2.2 镍柱亲和层析纯化蛋白 | 第31页 |
| 3.2.3 重组E.coli ThCel6A酶学性质研究 | 第31-33页 |
| 3.2.3.1 葡萄糖标准曲线的制作 | 第31-32页 |
| 3.2.3.2 蛋白质浓度标准曲线的制作 | 第32页 |
| 3.2.3.3 重组表达ThCel6A酶比活力测定 | 第32页 |
| 3.2.3.4 温度对重组ThCel6A的影响 | 第32-33页 |
| 3.2.3.5 pH对重组ThCel6A的影响 | 第33页 |
| 3.2.3.6 NaCl对重组ThCel6A的影响 | 第33页 |
| 3.2.3.7 乙醇对重组ThCel6A的影响 | 第33页 |
| 3.3 实验结果 | 第33-40页 |
| 3.3.1 重组表达菌株E.coli BL21/pET28a-ThCel6A的构建 | 第33-35页 |
| 3.3.2 重组ThCel6A的表达纯化 | 第35-36页 |
| 3.3.3 重组表达ThCel6A酶学性质研究 | 第36-40页 |
| 3.3.3.1 重组表达ThCel6A酶活测定 | 第36-38页 |
| 3.3.3.2 温度对ThCel6A的影响 | 第38页 |
| 3.3.3.3 pH对ThCel6A的影响 | 第38-39页 |
| 3.3.3.4 NaCl对ThCel6A的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.3.5 乙醇对ThCel6A的影响 | 第40页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第40-42页 |
| 第四章 耐乙醇纤维素酶ThCel6A的酵母表达及性质研究 | 第42-56页 |
| 4.1 实验材料 | 第42页 |
| 4.1.1 质粒与菌株 | 第42页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第42页 |
| 4.1.3 主要仪器设备 | 第42页 |
| 4.2 实验方法 | 第42-46页 |
| 4.2.1 真核表达载体pGAPZα C-ThCel6A的构建 | 第42-44页 |
| 4.2.1.1 引物设计 | 第42页 |
| 4.2.1.2 PCR扩增ThCel6A基因 | 第42-43页 |
| 4.2.1.3 重组表达载体构建 | 第43页 |
| 4.2.1.4 重组质粒转化E.coli DH5α | 第43页 |
| 4.2.1.5 菌落PCR鉴定重组子 | 第43页 |
| 4.2.1.6 重组质粒酶切鉴定 | 第43页 |
| 4.2.1.7 测序验证重组质粒 | 第43-44页 |
| 4.2.2 重组毕赤酵母的转化及筛选 | 第44-45页 |
| 4.2.2.1 线性化重组质粒 | 第44页 |
| 4.2.2.2 毕赤酵母感受态细胞制备 | 第44页 |
| 4.2.2.3 电转化毕赤酵母 | 第44页 |
| 4.2.2.4 CMC活性筛选重组子 | 第44-45页 |
| 4.2.2.5 重组酵母PCR鉴定 | 第45页 |
| 4.2.3 重组酵母表达ThCel6A | 第45-46页 |
| 4.2.3.1 重组酵母ThCel6A的表达 | 第45页 |
| 4.2.3.2 重组酵母ThCel6A酶活测定 | 第45页 |
| 4.2.3.3 温度对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第45-46页 |
| 4.2.3.4 pH对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第46页 |
| 4.2.3.5 乙醇对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第46页 |
| 4.2.4 重组酵母发酵 | 第46页 |
| 4.3 实验结果 | 第46-54页 |
| 4.3.1 重组表达载体pGAPZα C-ThCel6A的构建 | 第46-48页 |
| 4.3.1.1 菌落PCR鉴定重组子 | 第46-47页 |
| 4.3.1.2 重组质粒酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 4.3.1.3 重组质粒序列测定与分析 | 第48页 |
| 4.3.2 重组毕赤酵母的转化及筛选 | 第48-50页 |
| 4.3.2.1 重组质粒转化毕赤酵母 | 第48-49页 |
| 4.3.2.2 酵母重组子CMC活性 | 第49页 |
| 4.3.2.3 酵母重组子PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 4.3.3 重组酵母表达ThCel6A酶学性质 | 第50-53页 |
| 4.3.3.1 重组酵母ThCel6A酶活 | 第50页 |
| 4.3.3.2 温度对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第50-52页 |
| 4.3.3.3 pH对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第52页 |
| 4.3.3.4 乙醇对重组酵母ThCel6A酶活的影响 | 第52-53页 |
| 4.3.4 重组酵母C1发酵 | 第53-54页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 总结与展望 | 第56-57页 |
| 附录 | 第57-61页 |
| 参考文献 | 第61-68页 |
| 硕士期间成果 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
