| 摘要 | 第10-12页 |
| ABSTRACT | 第12-13页 |
| 缩略语表 | 第14-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-29页 |
| 1 LA-PCR的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.1 LA-PCR的基本原理及反应条件 | 第15-17页 |
| 1.1.1 LA-PCR原理及其酶系统 | 第15-16页 |
| 1.1.2 反应缓冲液 | 第16页 |
| 1.1.3 DNA模板与引物 | 第16页 |
| 1.1.4 热循环条件 | 第16-17页 |
| 1.2 LA-PCR技术在病毒学中的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.1 在病毒遗传变异和多态性方面的研究现状 | 第17页 |
| 1.2.2 用于快速构建病毒的全长感染性克隆或嵌合型感染性克隆 | 第17-18页 |
| 1.2.3 用于病理诊断 | 第18页 |
| 2 cDNA文库构建的研究进展 | 第18-21页 |
| 2.0 cDNA文库定义和概述 | 第18-19页 |
| 2.1 cDNA文库的构建原理及方法 | 第19页 |
| 2.2 影响cDNA文库构建的因素 | 第19-20页 |
| 2.2.1 足够的高质量的mRNA | 第19-20页 |
| 2.2.2 反转录及反转录效率 | 第20页 |
| 2.2.3 层析柱cDNA分级 | 第20页 |
| 2.3 cDNA文库应用 | 第20-21页 |
| 3 反向遗传学及其在冠状病毒中的研究应用 | 第21-23页 |
| 3.1 反向遗传学概述 | 第21页 |
| 3.2 反向遗传学的原理 | 第21页 |
| 3.3 冠状病毒反向遗传学系统的建立 | 第21-22页 |
| 3.3.1 全长cDNA分子装配策略 | 第22页 |
| 3.3.2 RNA病毒的拯救 | 第22页 |
| 3.4 反向遗传学技术在冠状病毒研究中的应用 | 第22-23页 |
| 3.4.1 用于研究基因组功能、病毒复制机制 | 第22页 |
| 3.4.2 用于研究病毒的致病机制 | 第22-23页 |
| 3.4.3 用于研发新型病毒载体 | 第23页 |
| 3.4.4 用于研究冠状病毒新型疫苗 | 第23页 |
| 4 鸭源性IBV ZZ2004毒株的研究进展 | 第23-29页 |
| 4.1 流行病学和临床症状 | 第24页 |
| 4.2 病毒的结构形态 | 第24页 |
| 4.3 病毒的生长特性 | 第24-25页 |
| 4.3.1 病毒在SPF鸡胚上的生长特性 | 第24-25页 |
| 4.3.2 病毒在细胞上的生长情况 | 第25页 |
| 4.4 病毒鉴定 | 第25-26页 |
| 4.5 病毒对肉仔鸡生长抑制的机理 | 第26页 |
| 4.6 病毒检测方法的建立 | 第26页 |
| 4.7 病毒全基因组的生物学信息 | 第26-29页 |
| 4.7.1 全基因序列特征与变异 | 第26-27页 |
| 4.7.2 S基因的分子特征与变异 | 第27-28页 |
| 4.7.3 M基因的分子特征与变异 | 第28页 |
| 4.7.4 N基因的分子特征与变异 | 第28-29页 |
| 引言 | 第29-31页 |
| 第二章 鸭源性IBV ZZ2004株长距离RT-PCR方法的建立 | 第31-43页 |
| 1 材料和方法 | 第31-37页 |
| 1.1 材料 | 第31-33页 |
| 1.1.1 病毒 | 第31页 |
| 1.1.2 试验动物 | 第31页 |
| 1.1.3 主要试验仪器 | 第31-32页 |
| 1.1.4 主要试剂 | 第32页 |
| 1.1.5 主要试剂配制 | 第32-33页 |
| 1.2 方法 | 第33-37页 |
| 1.2.1 病毒的复壮 | 第33页 |
| 1.2.2 鸡胚病毒尿囊液的处理 | 第33页 |
| 1.2.3 引物的设计与合成 | 第33-34页 |
| 1.2.4 病毒RNA的提取 | 第34页 |
| 1.2.5 反转录获得cDNA第一链 | 第34-35页 |
| 1.2.6 LA-PCR扩增双链cDNA | 第35-36页 |
| 1.2.7 3Step、2Step法引物浓度的优化 | 第36页 |
| 1.2.8 3Step法引物退火温度的优化 | 第36页 |
| 1.2.9 2Step法延伸时间的优化 | 第36页 |
| 1.2.10 PCR扩增产物的电泳鉴定 | 第36-37页 |
| 2 结果与分析 | 第37-40页 |
| 2.1 3Step、2Step法引物浓度的优化 | 第37页 |
| 2.2 3Step法不同引物退火温度扩增结果 | 第37-38页 |
| 2.3 2Step法不同延伸时间扩增结果 | 第38-39页 |
| 2.4 优化后的最佳LA-PCR反应体系及条件 | 第39-40页 |
| 3 讨论 | 第40-41页 |
| 3.1 体系优化 | 第40-41页 |
| 3.2 引物特异性 | 第41页 |
| 4 小结 | 第41-43页 |
| 第三章 RT-PCR构建鸭源性IBV ZZ2004株cDNA文库 | 第43-59页 |
| 1 材料和方法 | 第43-51页 |
| 1.1 材料 | 第43-45页 |
| 1.1.1 病毒 | 第43页 |
| 1.1.2 试验动物 | 第43页 |
| 1.1.3 主要试验仪器 | 第43页 |
| 1.1.4 主要试剂 | 第43-44页 |
| 1.1.5 主要试剂配制 | 第44-45页 |
| 1.2 方法 | 第45-51页 |
| 1.2.1 病毒的复壮 | 第45页 |
| 1.2.2 鸡胚病毒尿囊液的处理 | 第45页 |
| 1.2.3 引物的设计与合成 | 第45-47页 |
| 1.2.4 病毒RNA的提取 | 第47页 |
| 1.2.5 反转录制备cDNA | 第47页 |
| 1.2.6 PCR扩增双链cDNA | 第47页 |
| 1.2.7 PCR扩增产物的电泳鉴定 | 第47页 |
| 1.2.8 PCR产物的纯化回收 | 第47-48页 |
| 1.2.9 木端平滑DNA片段的3末端加“A”尾 | 第48-49页 |
| 1.2.10 A-Tailing DNA片段与pMD19-T载体的连接 | 第49页 |
| 1.2.11 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 | 第49页 |
| 1.2.12 连接产物的转化 | 第49-50页 |
| 1.2.13 重组质粒的提取和鉴定 | 第50页 |
| 1.2.14 采用通用引物PCR鉴定阳性克隆 | 第50-51页 |
| 1.2.15 基因组cDNA重叠片段的测序及序列分析 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-56页 |
| 2.1 鸭源性IBV ZZ2004毒株基因组RT-PCR分段扩增结果 | 第51-54页 |
| 2.2 PCR鉴定结果 | 第54-56页 |
| 3 讨论 | 第56-57页 |
| 4 小结 | 第57-59页 |
| 第四章 长距离RT-PCR构建鸭源性IBV ZZ2004毒株cDNA文库 | 第59-73页 |
| 1 材料和方法 | 第59-67页 |
| 1.1 材料 | 第59-60页 |
| 1.1.1 病毒 | 第59页 |
| 1.1.2 试验动物 | 第59页 |
| 1.1.3 主要试验仪器 | 第59页 |
| 1.1.4 主要试剂 | 第59-60页 |
| 1.1.5 主要试剂配制 | 第60页 |
| 1.2 方法 | 第60-67页 |
| 1.2.1 病毒的复壮 | 第60页 |
| 1.2.2 鸡胚病毒尿囊液的处理 | 第60页 |
| 1.2.3 引物的设计与合成 | 第60-61页 |
| 1.2.4 阳性模板RNA的抽提 | 第61-62页 |
| 1.2.5 反转录获得cDNA第一链 | 第62页 |
| 1.2.6 LA-PCR扩增双链cDNA | 第62页 |
| 1.2.7 PCR扩增产物的电泳鉴定 | 第62页 |
| 1.2.8 PCR产物的纯化回收 | 第62页 |
| 1.2.9 DNA片段与pGEM-T easy Vector载体的连接 | 第62-63页 |
| 1.2.10 JM109感受态细胞的制备 | 第63页 |
| 1.2.11 连接产物的转化 | 第63-64页 |
| 1.2.12 重组质粒的提取 | 第64页 |
| 1.2.13 采用通用引物PCR鉴定阳性克隆 | 第64页 |
| 1.2.14 重组质粒的双酶切鉴定 | 第64-66页 |
| 1.2.15 pFastBacHTA质粒的双酶切及纯化回收 | 第66页 |
| 1.2.16 2个大片段的IBV ZZ2004毒株cDNA文库的构建 | 第66-67页 |
| 1.2.17 基因组cDNA重叠片段的测序及序列分析 | 第67页 |
| 2 结果与分析 | 第67-71页 |
| 2.1 LA-PCR分段扩增的IBV ZZ2004毒株全基因组片段 | 第67-68页 |
| 2.2 四个片段的重组质粒的双酶切鉴定 | 第68-69页 |
| 2.3 两大片段重组质粒的PCR鉴定 | 第69-71页 |
| 3 讨论 | 第71-72页 |
| 4 小结 | 第72-73页 |
| 结论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 附图A pMD-19T Vector图谱 | 第81-82页 |
| 附图B pMD-19T Vector图谱 | 第82-83页 |
| 附图C pFastBacHTA质粒载体 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-87页 |
| 攻读学位期间发表的论文 | 第87页 |
