| 摘要 | 第4-8页 |
| ABSTRACT | 第8-13页 |
| 缩略词表 | 第17-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-40页 |
| 1.1 普瑞巴林及其化学-酶法制备 | 第18-25页 |
| 1.1.1 普瑞巴林 | 第18-19页 |
| 1.1.2 化学-酶法制备普瑞巴林 | 第19-25页 |
| 1.2 脂肪酶 | 第25-30页 |
| 1.2.1 脂肪酶概述 | 第25-26页 |
| 1.2.2 脂肪酶与酯酶的区别 | 第26-27页 |
| 1.2.3 脂肪酶的结构特征及催化机理 | 第27-29页 |
| 1.2.4 脂肪酶的应用 | 第29-30页 |
| 1.3 疏绵状嗜热丝孢菌及其脂肪酶 | 第30-32页 |
| 1.3.1 疏绵状嗜热丝孢菌 | 第30页 |
| 1.3.2 疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶 | 第30-32页 |
| 1.4 蛋白质分子改造策略 | 第32-37页 |
| 1.4.1 易错PCR | 第32-34页 |
| 1.4.2 DNA shuffling | 第34-35页 |
| 1.4.3 定点突变和定点饱和突变 | 第35页 |
| 1.4.4 迭代饱和突变和CASTing | 第35-36页 |
| 1.4.5 蛋白质末端融合与截断 | 第36-37页 |
| 1.5 立题依据、研究意义及主要研究内容 | 第37-40页 |
| 1.5.1 立题依据及研究意义 | 第37页 |
| 1.5.2 主要研究内容 | 第37-40页 |
| 第二章 Thermomyces lanuginosus DSM 10635脂肪酶/酯酶的克隆与表达 | 第40-58页 |
| 2.1 引言 | 第40-41页 |
| 2.2 材料与方法 | 第41-47页 |
| 2.2.1 材料 | 第41-42页 |
| 2.2.2 基本分子生物学实验方法 | 第42-43页 |
| 2.2.3 lanuginosus DSM 10635的培养 | 第43页 |
| 2.2.4 RNA的提取与逆转录 | 第43-44页 |
| 2.2.5 脂肪酶基因lip的克隆与表达 | 第44页 |
| 2.2.6 酯酶TLE的基因克隆、异源表达、分离纯化与表征 | 第44-46页 |
| 2.2.7 酶活测定 | 第46页 |
| 2.2.8 分析方法 | 第46-47页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第47-56页 |
| 2.3.1 lip基因的克隆与序列分析 | 第47-48页 |
| 2.3.2 脂肪酶Lip在大肠杆菌中表达 | 第48页 |
| 2.3.3 tle基因的克隆与分析 | 第48-51页 |
| 2.3.4 酯酶TLE的表达与纯化 | 第51-52页 |
| 2.3.5 酯酶TLE的酶学性质研究 | 第52-55页 |
| 2.3.6 脂肪酶Lip和酯酶TLE选择性水解CNDE | 第55-56页 |
| 2.4 本章小结 | 第56-58页 |
| 第三章 基于定点饱和突变策略的脂肪酶Lip分子改造 | 第58-74页 |
| 3.1 引言 | 第58页 |
| 3.2 材料与方法 | 第58-62页 |
| 3.2.1 材料 | 第58-60页 |
| 3.2.2 同源建模 | 第60页 |
| 3.2.3 分子对接 | 第60页 |
| 3.2.4 饱和突变文库的构建 | 第60页 |
| 3.2.5 高通量筛选模型的建立与突变文库的筛选 | 第60-61页 |
| 3.2.6 脂肪酶Lip和脂肪酶突变体的表达与分离纯化 | 第61-62页 |
| 3.2.7 酶活测定 | 第62页 |
| 3.2.8 酶的动力学参数测定 | 第62页 |
| 3.2.9 全细胞催化拆分CNDE | 第62页 |
| 3.2.10 分析方法 | 第62页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第62-72页 |
| 3.3.1 Lip的同源建模与结构分析 | 第62-63页 |
| 3.3.2 分子对接与突变位点的选择 | 第63-65页 |
| 3.3.3 突变文库的构建与筛选 | 第65-66页 |
| 3.3.4 脂肪酶Lip和突变体的纯化 | 第66-67页 |
| 3.3.5 动力学参数测定 | 第67-68页 |
| 3.3.6 机理分析 | 第68-72页 |
| 3.3.7 突变体动力学拆分CNDE | 第72页 |
| 3.4 本章小结 | 第72-74页 |
| 第四章 基于随机突变的脂肪酶Lip分子改造 | 第74-88页 |
| 4.1 引言 | 第74页 |
| 4.2 材料与方法 | 第74-78页 |
| 4.2.1 材料 | 第74-75页 |
| 4.2.2 DNA Shuffling | 第75-76页 |
| 4.2.3 epPCR | 第76-77页 |
| 4.2.4 随机突变文库的筛选 | 第77页 |
| 4.2.5 定点突变 | 第77页 |
| 4.2.6 定点饱和突变 | 第77页 |
| 4.2.7 突变体脂肪酶的分离纯化 | 第77页 |
| 4.2.8 酶活测定 | 第77页 |
| 4.2.9 动力学参数测定 | 第77页 |
| 4.2.10 动力学拆分CNDE | 第77-78页 |
| 4.2.11 产物对映体过量值和差向异构选择性检测 | 第78页 |
| 4.2.12 其它分析方法 | 第78页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第78-87页 |
| 4.3.1 DNA Shuffling突变文库的构建与筛选 | 第78-79页 |
| 4.3.2 epPCR突变文库的构建与筛选 | 第79页 |
| 4.3.3 单突变体S63L和D232A的获得 | 第79-80页 |
| 4.3.4 位点63和232定点饱和突变库的构建与筛选 | 第80-81页 |
| 4.3.5 突变体脂肪酶的表达与分离纯化 | 第81页 |
| 4.3.6 突变对酶选择性的影响 | 第81-82页 |
| 4.3.7 酶促反应动力学参数测定 | 第82-83页 |
| 4.3.8 结构与机理分析 | 第83-86页 |
| 4.3.9 全细胞催化CNDE水解 | 第86-87页 |
| 4.4 本章小结 | 第87-88页 |
| 第五章 阴离子树脂原位吸附耦合生物催化CNDE | 第88-100页 |
| 5.1 引言 | 第88页 |
| 5.2 材料与方法 | 第88-91页 |
| 5.2.1 材料 | 第88-89页 |
| 5.2.2 细胞的培养 | 第89-90页 |
| 5.2.3 转化条件的优化 | 第90页 |
| 5.2.4 树脂的选择 | 第90页 |
| 5.2.5 原位吸附 | 第90-91页 |
| 5.2.6 产物的分离与脱羧 | 第91页 |
| 5.2.7 转化率和产物对映体过量值的检测 | 第91页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第91-98页 |
| 5.3.1 菌体生长和产酶过程 | 第91-92页 |
| 5.3.2 转化条件的优化 | 第92-94页 |
| 5.3.3 树脂的筛选 | 第94-95页 |
| 5.3.4 树脂添加量的选择 | 第95页 |
| 5.3.5 阴离子树脂原位吸附耦合生物催化CNDE水解 | 第95-97页 |
| 5.3.6 产物的分离、脱羧与表征 | 第97-98页 |
| 5.4 本章小结 | 第98-100页 |
| 第六章 结论与展望 | 第100-104页 |
| 6.1 结论 | 第100-102页 |
| 6.2 展望 | 第102-104页 |
| 参考文献 | 第104-120页 |
| 附录 | 第120-126页 |
| 攻读博士期间发表论文与申请专利 | 第126-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
