| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-18页 |
| 1 猪流行性腹泻病毒（PEDV）研究进展 | 第11-17页 |
| 1.1 病原学 | 第11-14页 |
| 1.1.1 病毒分类及基本特性 | 第11-12页 |
| 1.1.2 病毒基因组分析 | 第12-14页 |
| 1.2 流行病学 | 第14-15页 |
| 1.3 传播方式及流行特点 | 第15页 |
| 1.4 临床症状与病理变化 | 第15-16页 |
| 1.5 发病机制 | 第16页 |
| 1.6 诊断与防制 | 第16-17页 |
| 2 本试验的研究目的和意义 | 第17-18页 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒全基因组测序 | 第18-37页 |
| 1 材料 | 第18-20页 |
| 1.1 细胞、毒株、菌种和载体 | 第18页 |
| 1.2 主要试剂 | 第18页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第18-19页 |
| 1.4 试剂配制 | 第19-20页 |
| 2 试验方法 | 第20-25页 |
| 2.1 PEDV CH/JX/01 TCID_(50)的测定 | 第20页 |
| 2.1.1 细胞培养 | 第20页 |
| 2.1.2 病毒增殖 | 第20页 |
| 2.1.3 PEDV CH/JX/01 TCID_(50)的测定 | 第20页 |
| 2.2 PEDV CH/JX/01/P50全基因组测定与分析 | 第20-25页 |
| 2.2.1 引物合成 | 第20-21页 |
| 2.2.2 病毒RNA提取 | 第21页 |
| 2.2.3 c DNA合成 | 第21页 |
| 2.2.4 目的片段的PCR扩增 | 第21页 |
| 2.2.5 目的片段的纯化 | 第21-22页 |
| 2.2.6 目的片段的T-A克隆 | 第22页 |
| 2.2.7 重组菌的扩大培养和鉴定 | 第22-23页 |
| 2.2.8 PEDV CH/JX/01/P50全基因组序列的拼接及其分析 | 第23页 |
| 2.2.9 PEDV系统遗传进化分析 | 第23-25页 |
| 3 结果 | 第25-36页 |
| 3.1 PEDV CH/JX/01 TCID_(50)的测定 | 第25页 |
| 3.2 全基因组PCR扩增结果 | 第25-26页 |
| 3.3 PEDV CH/JX/01/P50全基因组拼接以及不同代次全基因序列的比较分析 | 第26-28页 |
| 3.4 CH/JX/01/P50 株全基因组遗传进化分析 | 第28-32页 |
| 3.5 CH/JX/01/P50株全基因组同源性分析 | 第32-36页 |
| 4 讨论 | 第36-37页 |
| 第三章 猪流行性腹泻病毒N基因的原核表达及高免血清的制备 | 第37-55页 |
| 1 材料 | 第37-39页 |
| 1.1 实验动物、载体及菌种 | 第37页 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 | 第37页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第37页 |
| 1.4 试剂配制 | 第37-39页 |
| 2 试验方法 | 第39-46页 |
| 2.1 PEDV N基因重组质粒p MD-N的构建 | 第39-40页 |
| 2.1.1 引物的设计与合成 | 第39页 |
| 2.1.2 PEDV N基因的序列扩增 | 第39-40页 |
| 2.1.3 PEDV N基因的回收纯化 | 第40页 |
| 2.1.4 PEDV N基因的T-A克隆 | 第40页 |
| 2.1.5 重组菌的扩大培养和鉴定 | 第40页 |
| 2.1.6 重组质粒的提取 | 第40页 |
| 2.2 PEDV N基因重组表达质粒pcold-PEDV-N的构建 | 第40-41页 |
| 2.2.1 重组质粒p MD-N及pcold I原核表达载体的双酶切 | 第40页 |
| 2.2.2 目的基因和表达载体的连接 | 第40-41页 |
| 2.2.3 连接产物的转化 | 第41页 |
| 2.2.4 重组表达菌的扩大培养和鉴定 | 第41页 |
| 2.3 PEDV N蛋白的体外诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.3.1 重组蛋白的诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.3.2 重组蛋白表达条件的优化 | 第42页 |
| 2.3.3 重组蛋白表达形式的鉴定 | 第42页 |
| 2.4 重组蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| 2.4.1 重组蛋白的大量表达 | 第42-43页 |
| 2.4.2 重组蛋白的纯化 | 第43页 |
| 2.5 SDS-PAGE分析 | 第43页 |
| 2.6 蛋白免疫印迹（Western blot）分析 | 第43-44页 |
| 2.7 鼠抗PEDV N蛋白高免血清的制备 | 第44页 |
| 2.8 间接ELISA方法对血清效价的检测 | 第44-45页 |
| 2.9 高免血清的检测 | 第45-46页 |
| 2.9.1 间接ELISA检测 | 第45页 |
| 2.9.2 Western blot检测 | 第45页 |
| 2.9.3 间接免疫荧光（IFA）检测 | 第45-46页 |
| 3 试验结果 | 第46-54页 |
| 3.1 PEDV N基因重组质粒p MD-N的构建 | 第46-47页 |
| 3.1.1 目的基因的PCR扩增结果 | 第46页 |
| 3.1.2 重组菌的菌液鉴定 | 第46-47页 |
| 3.1.3 重组质粒p MD-N的测序鉴定 | 第47页 |
| 3.2 PEDV N基因重组表达质粒pcold-PEDV-N的构建 | 第47-48页 |
| 3.2.1 重组质粒p MD-N及pcold I原核表达载体的双酶切结果 | 第47页 |
| 3.2.2 重组表达菌的菌液鉴定 | 第47-48页 |
| 3.2.3 重组表达菌的测序结果 | 第48页 |
| 3.3 PEDV N基因重组蛋白的表达 | 第48-51页 |
| 3.3.1 重组蛋白的诱导表达结果 | 第48页 |
| 3.3.2 诱导时间的优化 | 第48-49页 |
| 3.3.3 IPTG诱导浓度的优化 | 第49-50页 |
| 3.3.4 重组蛋白表达形式的鉴定 | 第50页 |
| 3.3.5 重组蛋白的纯化结果 | 第50-51页 |
| 3.3.6 重组蛋白的Western blot分析 | 第51页 |
| 3.4 PEDV N蛋白血清抗体水平检测 | 第51页 |
| 3.5 高免血清的检测结果 | 第51-54页 |
| 3.5.1 间接ELISA检测结果 | 第51-53页 |
| 3.5.2 Western blot检测结果 | 第53页 |
| 3.5.3 间接免疫荧光（IFA）检测结果 | 第53-54页 |
| 4 讨论 | 第54-55页 |
| 全文总结 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 致谢 | 第61页 |
