| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第12-30页 |
| 1.1 结核病 | 第12-17页 |
| 1.1.1 结核病的疫情及其现状 | 第12-13页 |
| 1.1.2 结核病的传播途径 | 第13-14页 |
| 1.1.3 结核病疫苗 | 第14-16页 |
| 1.1.4 结核病的治疗 | 第16-17页 |
| 1.2 结核分枝杆菌简介 | 第17-20页 |
| 1.2.1 结核分枝杆菌的基本形态 | 第18页 |
| 1.2.2 结核分枝杆菌细胞壁的构成 | 第18-19页 |
| 1.2.3 结核分枝杆菌的抵抗力 | 第19页 |
| 1.2.4 结核分枝杆菌的毒力 | 第19-20页 |
| 1.3 结核分枝杆菌“假想”保守蛋白 | 第20-21页 |
| 1.4 蛋白质的分离纯化技术 | 第21-24页 |
| 1.4.1 蛋白质分离提纯的一般程序 | 第21页 |
| 1.4.2 蛋白质分离纯化的具体方法 | 第21-24页 |
| 1.5 蛋白质晶体学研究 | 第24-29页 |
| 1.5.1 蛋白质结晶的原理 | 第24页 |
| 1.5.2 蛋白质结晶的方法 | 第24-25页 |
| 1.5.3 蛋白质晶体的筛选和优化 | 第25-26页 |
| 1.5.4 影响蛋白质结晶的主要因素 | 第26页 |
| 1.5.5 X射线衍射蛋白质晶体的基本原理 | 第26-27页 |
| 1.5.6 蛋白质晶体X射线衍射的全过程 | 第27页 |
| 1.5.7 蛋白质晶体结构解析 | 第27-28页 |
| 1.5.8 蛋白质晶体学在药物中的应用 | 第28-29页 |
| 1.6 本研究的目的及意义 | 第29-30页 |
| 第2章 结核分枝杆菌Rv3899c的结构研究 | 第30-66页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-36页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第30页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第30-32页 |
| 2.1.3 相关溶液及其配置 | 第32-35页 |
| 2.1.3.1 培养基 | 第32-33页 |
| 2.1.3.2 主要缓冲液及其它溶液 | 第33-35页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第35-36页 |
| 2.2 实验方法 | 第36-48页 |
| 2.2.1 Rv3899c基因编码的蛋白质生物信息学分析 | 第36页 |
| 2.2.2 结核分枝杆菌全基因组的提取 | 第36-37页 |
| 2.2.3 结核分枝杆菌Rv3899c的克隆 | 第37-39页 |
| 2.2.3.1 Rv3899c的扩增 | 第37-38页 |
| 2.2.3.2 PCR扩增产物的回收 | 第38页 |
| 2.2.3.3 pET28a质粒的制备 | 第38页 |
| 2.2.3.4 载体质粒pET28a和目的基因Rv3988c的酶切、回收 | 第38页 |
| 2.2.3.5 双酶切产物的连接反应 | 第38-39页 |
| 2.2.3.6 重组质粒的转化 | 第39页 |
| 2.2.3.7 阳性克隆子的鉴定 | 第39页 |
| 2.2.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第39-43页 |
| 2.2.4.1 重组蛋白pET28a-Rv3899c的小量试表达 | 第39-40页 |
| 2.2.4.2 Western blot验证目的蛋白的表达情况 | 第40-41页 |
| 2.2.4.3 重组质粒pET28a-Rv3899c在大肠杆菌中的诱导表达 | 第41页 |
| 2.2.4.4 Ni-NTA亲和层析纯化His标签重组蛋白 | 第41页 |
| 2.2.4.5 蛋白浓缩 | 第41-42页 |
| 2.2.4.6 分子筛色谱纯化重组蛋白 | 第42-43页 |
| 2.2.5 蛋白质浓度的测定 | 第43-44页 |
| 2.2.6 Rv3899c的稳定性分析 | 第44页 |
| 2.2.7 融合蛋白的结晶及X射线衍射 | 第44-48页 |
| 2.2.7.1 重组融合蛋白的晶体培养 | 第44-47页 |
| 2.2.7.2 重组蛋白晶体X射线衍射 | 第47-48页 |
| 2.3 结果与分析 | 第48-64页 |
| 2.3.1 Rv3899c基因编码的蛋白质的生物信息学分析 | 第48-49页 |
| 2.3.2 M. tuberculosis基因组的提取 | 第49-50页 |
| 2.3.3 重组蛋白的构建 | 第50-52页 |
| 2.3.3.1 Rv3899c的基因扩增 | 第50页 |
| 2.3.3.2 重组载体pET28a-Rv3899c的双酶切验证 | 第50-51页 |
| 2.3.3.3 重组载体pET28a-Rv3899c的基因测序验证 | 第51-52页 |
| 2.3.4 融合蛋白pET28a-Rv3899c的试表达 | 第52-53页 |
| 2.3.5 融合蛋白pET28a-Rv3899c的Western Blot鉴定 | 第53-54页 |
| 2.3.6 融合蛋白pET28a-Rv3899c的大量表达与纯化 | 第54-55页 |
| 2.3.6.1 亲和层析 | 第54页 |
| 2.3.6.2 凝胶过滤层析 | 第54-55页 |
| 2.3.7 蛋白浓度的测定 | 第55-56页 |
| 2.3.8 Rv3899c的稳定性分析 | 第56页 |
| 2.3.9 Rv3899c蛋白晶体的获得及数据收集 | 第56-59页 |
| 2.3.9.1 Rv3899c蛋白晶体的初筛 | 第56-57页 |
| 2.3.9.2 Rv3899c蛋白晶体的优化 | 第57-58页 |
| 2.3.9.3 Rv3899c蛋白晶体的X射线衍射 | 第58-59页 |
| 2.3.10 晶体蛋白的Western Blot验证和N端测序验证 | 第59-61页 |
| 2.3.10.1 Western Blot验证 | 第60页 |
| 2.3.10.2 N端测序验证 | 第60-61页 |
| 2.3.10.3 N端测序结果 | 第61页 |
| 2.3.11 Rv3899c184410的重新构建、纯化、晶体筛选 | 第61-64页 |
| 2.3.11.1 Rv3899c184410的构建 | 第61-63页 |
| 2.3.11.2 Rv3899c184-410的表达纯化 | 第63-64页 |
| 2.3.11.3 Rv3899c184-410的结晶筛选 | 第64页 |
| 2.3.12 同晶置换进行相位解析 | 第64页 |
| 2.4 讨论 | 第64-66页 |
| 第3章 垂钓与Rv3899c相互作用的蛋白 | 第66-74页 |
| 3.1 实验材料 | 第66页 |
| 3.1.1 质粒和菌株 | 第66页 |
| 3.1.2 培养基 | 第66页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第66页 |
| 3.1.4 主要溶液 | 第66页 |
| 3.1.5 主要仪器 | 第66页 |
| 3.2 实验方法 | 第66-70页 |
| 3.2.1 GST垂钓与Rv3899c相互作用的蛋白 | 第66-69页 |
| 3.2.1.1 目的片段的构建 | 第66-67页 |
| 3.2.1.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第67-68页 |
| 3.2.1.3 结核分枝杆菌全蛋白的提取 | 第68页 |
| 3.2.1.4 GST垂钓相互作用的蛋白 | 第68页 |
| 3.2.1.5 银染 | 第68-69页 |
| 3.2.2 结核分枝杆菌蛋白质组芯片与Rv3899c相互作用 | 第69-70页 |
| 3.3 结果与分析 | 第70-73页 |
| 3.3.1 GST垂钓与Rv3899c相互作用蛋白 | 第70-72页 |
| 3.3.1.1 目的片段的构建 | 第70页 |
| 3.3.1.2 GST-Sepharose亲和层析 | 第70-71页 |
| 3.3.1.3 GST垂钓 | 第71页 |
| 3.3.1.4 银染 | 第71-72页 |
| 3.3.2 结核分枝杆菌蛋白质组芯片与Rv3899c相互作用 | 第72-73页 |
| 3.4 讨论 | 第73-74页 |
| 第4章 结论与展望 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 致谢 | 第81-83页 |
| 在读期间发表论文情况 | 第83页 |
