| 摘要 | 第10-13页 |
| Abstract | 第13-16页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第17-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-52页 |
| 1.1 引言 | 第20页 |
| 1.2 猪肠道冠状病毒的研究进展 | 第20-24页 |
| 1.2.1 猪冠状病毒的概述 | 第20-21页 |
| 1.2.2 猪冠状病毒的基因结构和功能 | 第21-24页 |
| 1.3 鉴定病毒的主要方法 | 第24-28页 |
| 1.3.1 病毒的分离 | 第26页 |
| 1.3.2 光学和电子显微镜的观察 | 第26页 |
| 1.3.3 抗原检测 | 第26-27页 |
| 1.3.4 病原检测 | 第27页 |
| 1.3.5 血清学检测方法 | 第27-28页 |
| 1.4 NGS的介绍和在兽医领域的应用 | 第28-35页 |
| 1.4.1 NGS的介绍 | 第28页 |
| 1.4.2 NGS的主要过程及问题 | 第28-29页 |
| 1.4.3 测序技术的发展情况简介和主要的第二代测序平台 | 第29-31页 |
| 1.4.4 NGS的主要应用有哪些 | 第31-32页 |
| 1.4.5 NGS在兽医领域的应用 | 第32-35页 |
| 1.5 PED的流行病学 | 第35-42页 |
| 1.5.1 PED的概述 | 第35页 |
| 1.5.2 PED的流行 | 第35-42页 |
| 1.6 猪传染性胃肠炎(TGE)和猪呼吸道冠状病毒病(PRC)的流行特点 | 第42-45页 |
| 1.6.1 TGE和PRC的概述 | 第42-43页 |
| 1.6.2 TGE和PRC的流行 | 第43-45页 |
| 1.7 猪冠状病毒病疫苗研究进展 | 第45-50页 |
| 1.7.1 TGE疫苗 | 第45-46页 |
| 1.7.2 北美使用的PED商业化疫苗 | 第46页 |
| 1.7.3 我国和其它东亚国家使用的PED商业化疫苗 | 第46-50页 |
| 1.8 PEDV的鉴别诊断研究 | 第50页 |
| 1.9 立题依据 | 第50-52页 |
| 第二章 我国PED流行情况及PEDV的分子特征 | 第52-84页 |
| 2.1 研究的目的及意义 | 第52页 |
| 2.2 材料与方法 | 第52-64页 |
| 2.2.1 病料 | 第52页 |
| 2.2.2 主要试剂 | 第52页 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 | 第52-53页 |
| 2.2.4 缓冲液及培养基 | 第53页 |
| 2.2.5 引物的设计和合成 | 第53-55页 |
| 2.2.6 样品的处理 | 第55页 |
| 2.2.7 样品RNA的提取 | 第55-56页 |
| 2.2.8 cDNA的合成 | 第56页 |
| 2.2.9 重组质粒的构建 | 第56-59页 |
| 2.2.10 序列信息的分析和比较 | 第59-64页 |
| 2.3 结果与分析 | 第64-81页 |
| 2.3.1 临床检测结果 | 第64-65页 |
| 2.3.2 PEDV毒株的S基因和全基因进化树分析 | 第65-67页 |
| 2.3.3 PEDVS基因和全基因相似性分析 | 第67-69页 |
| 2.3.4 PEDVS基因和全基因序列同源性分析 | 第69-70页 |
| 2.3.5 PEDVS基因的特征分析 | 第70页 |
| 2.3.6 PEDVS蛋白的特征分析 | 第70-72页 |
| 2.3.7 不同类型PEDV毒株基因特征分析 | 第72-73页 |
| 2.3.8 我国PEDV毒株部分S基因系统进化树分析 | 第73-75页 |
| 2.3.9 我国PEDV毒株的系统进化地理分布 | 第75-76页 |
| 2.3.10 我国PEDV毒株的序列同源性、抗原指数和亲水性图分析 | 第76-79页 |
| 2.3.11 区分不同类型PEDV毒株分子标记 | 第79-81页 |
| 2.4 讨论 | 第81-83页 |
| 2.5 小结 | 第83-84页 |
| 第三章 美国PED的流行特点和分子特点研究 | 第84-99页 |
| 3.1 研究的目的及意义 | 第84页 |
| 3.2 材料与方法 | 第84-87页 |
| 3.2.1 数据与样品 | 第84页 |
| 3.2.2 主要设备和试剂 | 第84页 |
| 3.2.3 RNA的提取 | 第84-85页 |
| 3.2.4 二重RT-PCR用于区分INDELs和非INDELs毒株 | 第85-86页 |
| 3.2.5 扩增产物的测序 | 第86页 |
| 3.2.6 二重RT-PCR方法的特异性 | 第86页 |
| 3.2.7 二重RT-PCR方法的敏感性 | 第86页 |
| 3.2.8 二重RT-PCR方法的临床应用及其与定量检测方法的一致性 | 第86页 |
| 3.2.9 统计分析 | 第86-87页 |
| 3.3 结果 | 第87-96页 |
| 3.3.1 临床检测结果 | 第87-88页 |
| 3.3.2 猪肠道冠状病毒的地理分布 | 第88-91页 |
| 3.3.3 不同样品中猪冠状病毒的检测情况 | 第91页 |
| 3.3.4 美国流行PEDV毒株的类型 | 第91-93页 |
| 3.3.5 二重常规PEDV鉴别诊断RT-PCR的建立(特异性和灵敏性) | 第93-94页 |
| 3.3.6 二重常规PEDV鉴别诊断RT-PCR产物的测序验证 | 第94页 |
| 3.3.7 二重常规RT-PCR方法与定量检测方法的比较 | 第94-96页 |
| 3.4 讨论 | 第96-98页 |
| 3.5 小结 | 第98-99页 |
| 第四章 新型PEDV毒株的分离鉴定和传代致弱研究 | 第99-123页 |
| 4.1 研究的目的与意义 | 第99页 |
| 4.2 材料 | 第99-101页 |
| 4.2.1 病料采集 | 第99页 |
| 4.2.2 细胞、菌株、载体和重要的仪器和设备 | 第99页 |
| 4.2.3 工具酶及主要试剂 | 第99-100页 |
| 4.2.4 培养基及相关试剂的配制 | 第100-101页 |
| 4.3 实验方法 | 第101-107页 |
| 4.3.1 病料的处理 | 第101页 |
| 4.3.2 病毒的分离方法 | 第101-102页 |
| 4.3.3 PEDV的增殖 | 第102页 |
| 4.3.4 毒价的测定 | 第102页 |
| 4.3.5 细胞样品RNA的提取 | 第102-103页 |
| 4.3.6 间接免疫荧光(IFA) | 第103页 |
| 4.3.7 病毒空斑纯化 | 第103页 |
| 4.3.8 病毒生长曲线的绘制 | 第103-104页 |
| 4.3.9 病毒形态学 | 第104页 |
| 4.3.10 新型PEDV毒株的连续传代 | 第104页 |
| 4.3.11 YN1不同代次PEDV毒株的特性 | 第104-105页 |
| 4.3.12 传代后PEDV毒株的致病性研究 | 第105-107页 |
| 4.3.13 YN144临床安全性初步研究 | 第107页 |
| 4.3.14 统计分析 | 第107页 |
| 4.4 结果和分析 | 第107-119页 |
| 4.4.1 病毒的分离 | 第107-109页 |
| 4.4.2 间接荧光免疫(IFA) | 第109页 |
| 4.4.3 透射电镜观察YN1的病毒形态 | 第109页 |
| 4.4.4 不同代次PEDV毒株的生长特性 | 第109-110页 |
| 4.4.5 PEDVYN1毒株不同代次毒株致病性实验 | 第110-112页 |
| 4.4.6 不同代次全基因组序列的测定和核苷酸序列比较 | 第112-119页 |
| 4.4.7 YN144临床安全性初步研究 | 第119页 |
| 4.5 讨论 | 第119-122页 |
| 4.6 小结 | 第122-123页 |
| 第五章 下一代测序技术在挖掘新病原的初步应用 | 第123-143页 |
| 5.1 研究的目的及意义 | 第123页 |
| 5.2 材料与方法 | 第123-130页 |
| 5.2.1 数据和样品 | 第123页 |
| 5.2.2 主要试剂、仪器和设备 | 第123页 |
| 5.2.3 安全注意事项 | 第123-124页 |
| 5.2.4 样品的处理 | 第124页 |
| 5.2.5 样品RNA的提取 | 第124-126页 |
| 5.2.6 IllumimaTruSeqRNA文库的制备和验证 | 第126页 |
| 5.2.7 NGS测序 | 第126-127页 |
| 5.2.8 序列信息的分析和比较 | 第127-130页 |
| 5.3 结果和分析 | 第130-141页 |
| 5.3.1 新型TGEV毒株的鉴定 | 第130页 |
| 5.3.2 不同TGEV和PRCV毒株全基因组的获得 | 第130-132页 |
| 5.3.3 2008-2016年间美国TGEV检测数据 | 第132-134页 |
| 5.3.4 TGEV和PRCV毒株基因组特点 | 第134-135页 |
| 5.3.5 TGEV毒株的变异性分析 | 第135页 |
| 5.3.6 TGEV毒株的entropy分析 | 第135-136页 |
| 5.3.7 TGEV毒株的重组分析 | 第136-137页 |
| 5.3.8 TGEV和PRCV进化树和地理分布分析 | 第137-139页 |
| 5.3.9 蛋白同源模建 | 第139-141页 |
| 5.4 讨论 | 第141-142页 |
| 5.5 小结 | 第142-143页 |
| 第六章 全文总结 | 第143-145页 |
| 参考文献 | 第145-168页 |
| 附录 | 第168-182页 |
| 基本信息 | 第182-185页 |
| 致谢 | 第185-187页 |
