| 致谢 | 第6-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| Abstract | 第9页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-35页 |
| 1. 双生病毒的概述及研究进展 | 第15-26页 |
| 1.1 双生病毒的概述与分类 | 第15-17页 |
| 1.2 双生病毒基因组结构及编码蛋白的功能 | 第17-19页 |
| 1.3 双生病毒的复制 | 第19-21页 |
| 1.4 双生病毒的致病机制 | 第21-26页 |
| 1.4.1 双生病毒对细胞周期的调控 | 第21-23页 |
| 1.4.2 双生病毒对泛素化途径及类泛素化途径的调控 | 第23-24页 |
| 1.4.3 双生病毒对基因沉默途径的调控 | 第24-26页 |
| 1.5 云南番茄曲叶病毒(Tomato leaf curl Yunnan virus,TLCYnV)概述 | 第26页 |
| 2. 油菜素内酯(Brassinosteriod, BR)信号通路研究进展 | 第26-29页 |
| 2.1 油菜素内酯概述 | 第26-27页 |
| 2.2 油菜素内酯信号转导通路中的组份及功能 | 第27-29页 |
| 2.2.1 油菜素内酯信号的识别及信号在细胞膜上的传递 | 第27-28页 |
| 2.2.1.1 油菜素内酯信号识别受体BRI1 | 第27页 |
| 2.2.1.2 BRI1伴随受体激酶BAK1 | 第27页 |
| 2.2.1.3 BRI1激酶抑制子BKI1 | 第27-28页 |
| 2.2.2 细胞质中的BR信号激酶与磷酸酶 | 第28页 |
| 2.2.2.1 BR信号激酶BSK1和BRI1抑制子BSU1 | 第28页 |
| 2.2.2.2 BR不敏感激酶BIN2 (2.2.3细胞核中的BR信号传递 | 第28页 |
| 2.2.3 细胞核中的BR信号传递 | 第28页 |
| 2.2.3.1 BR信号途径末端的转录因子BZR1和BES1 | 第28页 |
| 2.2.4 油菜素内酯信号转导 | 第28-29页 |
| 3. 植物细胞周期研究进展 | 第29-32页 |
| 3.1 细胞周期与细胞分类 | 第29-32页 |
| 3.1.1 植物细胞周期中的组份及其功能 | 第30-32页 |
| 3.1.2 细胞周期中的内循环 | 第32页 |
| 4. 蛋白质翻译后修饰(Posttranslational modifications,PTMs)研究进展 | 第32-34页 |
| 4.1 磷酸化修饰在植物-病毒互作中的作用 | 第32-33页 |
| 4.2 蛋白质N端豆蔻酰化修饰(N-myristoylation) | 第33页 |
| 4.3 蛋白质翻译后修饰间的相互影响(Crosstalk) | 第33-34页 |
| 4.4 蛋白质翻译后修饰对蛋白质核穿梭的影响 | 第34页 |
| 5. 论文的主要工作和意义 | 第34-35页 |
| 第二章 材料与方法 | 第35-44页 |
| 1. 材料 | 第35页 |
| 1.1 植物材料 | 第35页 |
| 1.2 病毒侵染性克隆 | 第35页 |
| 1.3 菌株和质粒 | 第35页 |
| 1.4 试剂 | 第35页 |
| 2. 方法 | 第35-44页 |
| 2.1 PCR技术 | 第35-37页 |
| 2.1.1 常规PCR | 第35-36页 |
| 2.1.2 高保真DNA聚合酶PCR | 第36页 |
| 2.1.3 Overlap Extension PCR | 第36-37页 |
| 2.2 PCR产物及目的片段纯化 | 第37页 |
| 2.3 DNA克隆技术 | 第37-39页 |
| 2.3.1 TA连接 | 第37-38页 |
| 2.3.2 限制酶切口黏性末端连接 | 第38页 |
| 2.3.3 感受态细胞制备 | 第38页 |
| 2.3.4 转化 | 第38-39页 |
| 2.4 质粒的提取与鉴定 | 第39页 |
| 2.4.1 质粒小量提取试剂盒提取质粒 | 第39页 |
| 2.4.2 PCR鉴定阳性克隆 | 第39页 |
| 2.4.3 酶切鉴定 | 第39页 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳 | 第39-40页 |
| 2.6 Western blot | 第40页 |
| 2.7 酵母双杂交验证蛋白互作 | 第40-41页 |
| 2.7.1 酵母的转化 | 第40-41页 |
| 2.7.2 蛋白互作的验证 | 第41页 |
| 2.8 双分子荧光互补实验 | 第41页 |
| 2.9 植物RNA提取,反转录和RT-PCR | 第41-42页 |
| 2.9.1 植物RNA提取 | 第41-42页 |
| 2.9.2 植物RNA的反转录 | 第42页 |
| 2.9.3 RT-PCR | 第42页 |
| 2.9.3.1 半定量RT-PCR | 第42页 |
| 2.9.3.2 定量RT-PCR | 第42页 |
| 2.10 农杆菌浸润接种植物 | 第42页 |
| 2.11 双分子荧光互补试验 | 第42-44页 |
| 第三章 云南番茄曲叶病毒致病因子C4对NbSKη亚细胞定位的影响 | 第44-68页 |
| 1. 材料 | 第44页 |
| 1.1 毒源 | 第44页 |
| 1.2 抗体 | 第44页 |
| 2. 方法 | 第44-49页 |
| 2.1 亚细胞结构分离试验(Subcellular Fractionation Assay) | 第44-45页 |
| 2.2 膜悬浮试验(Membrane Flotation Assay) | 第45页 |
| 2.3 与云南番茄曲叶病毒C4蛋白互作寄主因子的筛选试验 | 第45-47页 |
| 2.3.1 酵母菌株的活化 | 第45页 |
| 2.3.2 诱饵蛋白C4对酵母毒性及其自激活活性的检测 | 第45页 |
| 2.3.3 与TLCYnV C4互作因子的筛选 | 第45-47页 |
| 2.3.3.1 酵母感受态的制备 | 第45-46页 |
| 2.3.3.2 诱饵质粒pGBKT7-C4与文库质粒共转化AH109感受态细胞 | 第46页 |
| 2.3.3.3 TLCYnV C4互作因子筛选 | 第46页 |
| 2.3.3.4 酵母质粒的提取 | 第46-47页 |
| 2.3.3.5 候选互作因子的分离与确定 | 第47页 |
| 2.3.3.6 候选互作因子基因全长的克隆及互作验证 | 第47页 |
| 2.4 植物细胞核与细胞质分离试验(Nuclear-cytoplasmic Fractionation Assay) | 第47-48页 |
| 2.5 免疫共沉淀试验(Co-immunoprecipitation,Co-IP) | 第48页 |
| 2.6 免疫组织化学试验和透射电镜观察 | 第48-49页 |
| 2.6.1 样品的低温包埋 | 第48-49页 |
| 2.6.2 免疫胶体金标记 | 第49页 |
| 3. 结果与分析 | 第49-67页 |
| 3.1 采用酵母双杂交筛选本氏烟cDNA文库及候选基因的克隆 | 第49页 |
| 3.2 互作寄主因子在植物中的生理学功能 | 第49-50页 |
| 3.3 NbSKη与TLCYnV C4互作的验证 | 第50-52页 |
| 3.3.1 NbSKη与TLCYnV C4在酵母中的相互作用 | 第50-51页 |
| 3.3.2 NbSKη与TLCYnV C4在植物体内的相互作用 | 第51-52页 |
| 3.4 NbSKη与TLCYnV C4的互作对C4致病性的影响 | 第52-55页 |
| 3.4.1 利用酵母双杂交系统对C4与NbSKη互作关键位点的筛选 | 第52-53页 |
| 3.4.2 NbSKη与TLCYnV C4的互作对C4致病性的影响 | 第53-55页 |
| 3.5 TLCYnV C4对NbSKη亚细胞定位的影响 | 第55-63页 |
| 3.5.1 TLCYnV C4的亚细胞定位 | 第55-57页 |
| 3.5.2 NbSK的亚细胞定位 | 第57页 |
| 3.5.3 TLCYnV C4对NbSKη亚细胞定位的影响 | 第57-63页 |
| 3.6 NbSKη在TLCYnV C4致病性中的作用 | 第63-66页 |
| 3.6.1 沉默NbSKη的本氏烟表型与TLCYnV C4本氏烟表型相似 | 第63-65页 |
| 3.6.2 沉默NbSKη的本氏烟对PVX-C4敏感性的影响 | 第65-66页 |
| 3.7 35S::TLCYnV C4转基因拟南芥产生与过表达BZR1相似的表型 | 第66-67页 |
| 4. 讨论 | 第67-68页 |
| 第四章 TLCYnV C4改变NbSKη亚细胞定位分子机制的研究 | 第68-89页 |
| 1. 材料 | 第68页 |
| 1.1 病毒 | 第68页 |
| 1.2 抗体 | 第68页 |
| 2. 方法 | 第68-70页 |
| 2.1 利用[γ-~(32)P] ATP的体外磷酸化试验 | 第68-69页 |
| 2.2 利用Cold ATP的体外磷酸化试验 | 第69页 |
| 2.3 体外豆蔻酰化试验 | 第69页 |
| 2.3.1 豆蔻酰化试验底物准备 | 第69页 |
| 2.3.2 体外豆蔻酰化试验 | 第69页 |
| 2.4 Tricine SDS-PAGE | 第69-70页 |
| 2.4.1 12% Tricine分离胶的制备 | 第69-70页 |
| 2.4.2 5%浓缩胶的制备 | 第70页 |
| 2.4.3 Tricine SDS-PAGE | 第70页 |
| 2.5 光转换试验 | 第70页 |
| 3. 结果与分析 | 第70-88页 |
| 3.1 NbSKη磷酸化TLCYnV C4且C4的第51位Thr是潜在磷酸化位点 | 第70-72页 |
| 3.2 NbSKη对TLCYnV C4的磷酸化影响C4对NbSKη亚细胞定位的改变 | 第72-75页 |
| 3.2.1 TLCYnV C4 (T51A)不影响其与NbSKη的互作但影响其致病性 | 第72-73页 |
| 3.2.2 NbSKη对TLCYnV C4的磷酸化影响C4介导的NbSKη亚细胞定位改变 | 第73-74页 |
| 3.2.3 TLCYnV C4的磷酸化对于C4改变NbSKη亚细胞定位是必需的 | 第74-75页 |
| 3.3 TLCYnV C4N端豆蔻酰化修饰影响C4对NbSKη亚细胞定位改变 | 第75-77页 |
| 3.3.1 TLCYnV C4通过N端豆蔻酰化修饰而定位至细胞膜上 | 第75-77页 |
| 3.3.2 TLCYnV C4N端豆蔻酰化修饰对NbSKη亚细胞定位的影响 | 第77页 |
| 3.4 TLCYnV C4 N端豆蔻酰化修饰对TLCYnV C4致病性的影响 | 第77-78页 |
| 3.5 NbSKη对TLCYnV C4的磷酸化修饰促进C4的N端豆蔻酰化修饰 | 第78-79页 |
| 3.6 NbSKη对TLCYnV C4的磷酸化介导C4的核质穿梭 | 第79-83页 |
| 3.6.1 NbSKη在细胞核中将TLCYnV C4磷酸化 | 第80页 |
| 3.6.2 TLCYnV C4的核输出过程依赖核输出蛋白(Exportin-α) | 第80-81页 |
| 3.6.3 利用光转换蛋白Dendra2检测TLCYnV C4的核输出过程 | 第81-83页 |
| 3.7 NbSKη对TLCYnV C4的磷酸化介导TLCYnV C4的核输出 | 第83页 |
| 3.8 TLCYnV C4核输出伴随NbSKη出核 | 第83-85页 |
| 3.9 TLCYnV C4与核输出蛋白(Exportin-α) XPOI互作 | 第85-87页 |
| 3.9.1 TLCYnV C4出核信号的鉴定 | 第85-86页 |
| 3.9.2 TLCYnV C4与核输出蛋白(Exportin-α) XPOI互作 | 第86-87页 |
| 3.10 由NbSKη磷酸化介导的TLCYnV C4核穿梭过程影响C4的致病性 | 第87-88页 |
| 4. 讨论 | 第88-89页 |
| 第五章 TLCYnV C4与NbSKη互作生物学意义的研究 | 第89-106页 |
| 1. 材料 | 第89页 |
| 1.1 病毒 | 第89页 |
| 1.2 抗体 | 第89页 |
| 2. 方法 | 第89-90页 |
| 2.1 利用[γ-~(32)P] ATP的体外磷酸化试验 | 第89页 |
| 2.2 利用Cold ATP的体外磷酸化试验 | 第89-90页 |
| 2.3 半体内蛋白降解试验 | 第90页 |
| 2.4 半体内MG132抑制蛋白降解试验 | 第90页 |
| 3. 结果与分析 | 第90-105页 |
| 3.1 TLCYnV C4可以诱导细胞分裂 | 第91-92页 |
| 3.2 油菜素内酯信号转导途径参与TLCYnV C4转基因本氏烟叶片上突起的形成 | 第92页 |
| 3.3 NbSKη负调控叶片突起表型的产生 | 第92-94页 |
| 3.4 TLCYnV C4通过与NbSKη互作影响本氏烟叶片突起症状的产生 | 第94页 |
| 3.5 TLCYnV C4主要影响细胞周期的G1期 | 第94-95页 |
| 3.6 NbSKη与本氏烟NbCycD1;1蛋白互作 | 第95-96页 |
| 3.7 35S::NbCycD1;1转基因本氏烟表现出35S::TLCYnV C4转基因本氏烟的表型 | 第96-97页 |
| 3.8 NbSKη通过磷酸化影响NbCycD1;1的稳定性 | 第97-102页 |
| 3.8.1 NbCycD1;1的亚细胞定位及蛋白稳定性 | 第97-98页 |
| 3.8.2 NbSKη磷酸化NbCycD1;1 | 第98-99页 |
| 3.8.3 NbSKη通过磷酸化NbCycD1;1影响NbCycD1;1的稳定性 | 第99-102页 |
| 3.9 TLCYnV C4通过与NbSKη互作增加NbCycD1;1的蛋白稳定性 | 第102-103页 |
| 3.9.1 TLCYnV C4可以增加NbCycD1;1的蛋白稳定性 | 第102-103页 |
| 3.10 通过半体内蛋白降解试验证明TLCYnV C4抑制NbCycD1;1的降解 | 第103-105页 |
| 4. 讨论 | 第105-106页 |
| 第六章 全文总结 | 第106-108页 |
| 参考文献 | 第108-126页 |
| 附录A 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 | 第126-127页 |
| 附录B 常用缓冲液及培养基配方 | 第127-131页 |
