| 摘要 | 第4-7页 |
| ABSTRACT | 第7-10页 |
| 第一章 前言 | 第16-28页 |
| 1.1 β-丙氨酸 | 第16-19页 |
| 1.1.1 β-丙氨酸的应用 | 第16-18页 |
| 1.1.2 β-丙氨酸的合成 | 第18-19页 |
| 1.2 L-天冬氨酸α-脱羧酶基因(PanD) | 第19-20页 |
| 1.2.1 panD基因的发现 | 第19页 |
| 1.2.2 panD基因的结构 | 第19-20页 |
| 1.2.3 PanD的结构功能 | 第20页 |
| 1.3 PanD酶的三维结构 | 第20-21页 |
| 1.4 PanD酶的裂解机制 | 第21-22页 |
| 1.5 PanD酶的催化机理 | 第22-23页 |
| 1.6 PanD酶的克隆表达与酶学性质研究现状 | 第23-24页 |
| 1.7 海洋微生物 | 第24-25页 |
| 1.8 红树林生态系统及其研究状况 | 第25页 |
| 1.9 本课题研究的目的意义和研究内容 | 第25-27页 |
| 1.9.1 本课题研究的目的意义 | 第25-26页 |
| 1.9.2 本课题的主要研究内容 | 第26-27页 |
| 1.10 本研究的实验技术路线 | 第27-28页 |
| 第二章 材料与方法 | 第28-47页 |
| 2.1 主要仪器及设备 | 第28页 |
| 2.2 使用的菌株和质粒 | 第28-29页 |
| 2.3 常用的药品和酶制剂 | 第29页 |
| 2.4 培养基及试剂的配置 | 第29-32页 |
| 2.5 环境样品的采集和处理 | 第32页 |
| 2.6 PanD产生菌的筛选 | 第32-33页 |
| 2.7 菌株的生理生化性质鉴定 | 第33-35页 |
| 2.7.1 革兰氏染色 | 第33页 |
| 2.7.2 芽孢染色 | 第33页 |
| 2.7.3 细菌菌落形态观察 | 第33-34页 |
| 2.7.4 细菌运动性观察 | 第34页 |
| 2.7.5 氧化酶试验 | 第34页 |
| 2.7.6 接触酶试验 | 第34页 |
| 2.7.7 硝酸盐还原试验 | 第34页 |
| 2.7.8 淀粉水解试验 | 第34-35页 |
| 2.7.9 丙酸盐利用试验 | 第35页 |
| 2.7.10 糖发酵试验 | 第35页 |
| 2.7.11 厌氧生长试验 | 第35页 |
| 2.7.12 吲哚试验 | 第35页 |
| 2.7.13 碳源利用 | 第35页 |
| 2.7.14 氮源利用 | 第35页 |
| 2.8 常规PCR反应体系及程序 | 第35-36页 |
| 2.9 基因工程菌的构建 | 第36-38页 |
| 2.9.1 细菌基因组DNA的提取 | 第36-37页 |
| 2.9.2 质粒的提取 | 第37页 |
| 2.9.3 DNA的双酶切 | 第37页 |
| 2.9.4 DNA酶切产物和PCR产物的回收纯化 | 第37页 |
| 2.9.5 DNA的连接 | 第37-38页 |
| 2.9.6 感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.10 目的蛋白的表达与纯化 | 第38-40页 |
| 2.10.1 目的蛋白的表达 | 第38-39页 |
| 2.10.2 目的蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| 2.11 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳 | 第40-41页 |
| 2.11.1 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶的制备 | 第40页 |
| 2.11.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第40-41页 |
| 2.12 β-丙氨酸及L-天冬氨酸浓度的HPLC检测方法 | 第41-43页 |
| 2.12.1 重组酶最适酶量的测定 | 第41页 |
| 2.12.2 重组酶最适底物浓度的测定 | 第41页 |
| 2.12.3 重组酶最适反应时间的测定 | 第41页 |
| 2.12.4 重组酶最适温度的测定 | 第41-42页 |
| 2.12.5 重组酶热稳定性的测定 | 第42页 |
| 2.12.6 重组酶最适pH的测定 | 第42页 |
| 2.12.7 重组酶pH稳定性的测定 | 第42页 |
| 2.12.8 金属离子对重组酶活力的影响 | 第42页 |
| 2.12.9 重组酶的动力学研究 | 第42-43页 |
| 2.13 突变位点的设计 | 第43页 |
| 2.14 突变子的构建与鉴定 | 第43-46页 |
| 2.14.1 突变子的构建 | 第43-46页 |
| 2.14.2 突变子的鉴定 | 第46页 |
| 2.15 突变子性能比较和结构分析 | 第46-47页 |
| 2.15.1 突变酶的最适温度和温度稳定性 | 第46页 |
| 2.15.2 突变酶的最适pH和pH稳定性 | 第46页 |
| 2.15.3 突变酶的动力学参数 | 第46-47页 |
| 第三章 结果与分析 | 第47-88页 |
| 3.1 PanD产生菌的筛选 | 第47-49页 |
| 3.2 菌株的常规生理生化的鉴定 | 第49-53页 |
| 3.2.1 菌株的形态特征 | 第49-50页 |
| 3.2.2 菌株GZ1的生理生化特性 | 第50-52页 |
| 3.2.3 菌株的生长曲线 | 第52-53页 |
| 3.3 菌株的分子生物学鉴定 | 第53-55页 |
| 3.3.1 细菌基因组DNA的提取 | 第53页 |
| 3.3.2 菌株的16S rRNA序列分析 | 第53-54页 |
| 3.3.3 16S rRNA的测序 | 第54页 |
| 3.3.4 菌株GZ1 16S rRNA序列进化树的构建 | 第54-55页 |
| 3.4 目的基因的克隆 | 第55-56页 |
| 3.5 生物信息学分析 | 第56-73页 |
| 3.5.1 生物信息学分析 | 第56-57页 |
| 3.5.2 panDP的生物信息学分析 | 第57-64页 |
| 3.5.3 panDA的生物信息学分析 | 第64-72页 |
| 3.5.4 小结 | 第72-73页 |
| 3.6 构建重组质粒 | 第73-74页 |
| 3.7 重组蛋白PanD的表达纯化 | 第74-79页 |
| 3.7.1 构建重组表达菌株 | 第74-75页 |
| 3.7.2 重组蛋白PanD的表达纯化 | 第75-79页 |
| 3.8 产物的鉴定 | 第79-81页 |
| 3.9 重组蛋白PanDP的酶学性质鉴定 | 第81-88页 |
| 3.9.1 温度对重组蛋白PanDP的影响 | 第81-83页 |
| 3.9.2 pH对重组蛋白PanDP的影响 | 第83-85页 |
| 3.9.3 金属离子对重组蛋白PanDP的影响 | 第85-86页 |
| 3.9.4 重组蛋白PanDP动力学参数的测定 | 第86-88页 |
| 第四章 基因panDP的改造及突变酶的功能研究 | 第88-96页 |
| 4.1 基因panDP的改造 | 第88-90页 |
| 4.2 突变重组表达质粒的构建 | 第90-93页 |
| 4.3 突变重组蛋白的表达纯化 | 第93-95页 |
| 4.3.1 构建重组表达菌株 | 第93页 |
| 4.3.2 突变重组蛋白的表达纯化 | 第93-95页 |
| 4.4 突变重组蛋白的活性 | 第95页 |
| 4.5 本章小结 | 第95-96页 |
| 第五章 总结与展望 | 第96-101页 |
| 5.1 总结 | 第96-100页 |
| 5.1.1 天冬氨酸α-脱羧酶菌株的筛选 | 第96页 |
| 5.1.2 菌株的鉴定 | 第96-97页 |
| 5.1.3 目的基因的克隆及分析 | 第97-98页 |
| 5.1.4 重组蛋白的酶学性质测定 | 第98-100页 |
| 5.1.5 突变酶的酶学性质 | 第100页 |
| 5.2 展望 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-111页 |
| 附录 | 第111-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 硕士阶段发表论文情况 | 第117页 |
