| Abstract | 第5-7页 |
| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abbreviations | 第10-12页 |
| 第一章 研究背景 | 第12-28页 |
| 一、研究历史 | 第12-17页 |
| (一) CRISPR的发现 | 第12-14页 |
| (二) CRISPR系统分类 | 第14-15页 |
| (三) 利用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑 | 第15-16页 |
| (四) 利用CRISPR-Cas系统进行基因表达的调控 | 第16页 |
| (五) CRISPR-Cas系统应用于转化医学 | 第16-17页 |
| (六) CRISPR-Cas的脱靶效应 | 第17页 |
| 二、肿瘤的免疫治疗 | 第17-28页 |
| (一) 免疫治疗的发展 | 第17-18页 |
| (二) T细胞为主体的ACT治疗 | 第18-19页 |
| (三) TCR-T和CAR-T的发展 | 第19-21页 |
| (1) TCR基因导入 | 第19-20页 |
| (2) CAR基因导入 | 第20-21页 |
| (四) 免疫抑制检查点和抗体阻断药物 | 第21-26页 |
| (1) CTLA-4与肿瘤免疫 | 第22-23页 |
| (2) PD-1与肿瘤免疫 | 第23-25页 |
| (3) CTLA-4和PD-1抗体阻断药物的临床应用 | 第25-26页 |
| (五) 联合免疫治疗 | 第26-28页 |
| 第二章 利用CISPR-Cas9技术介导的T细胞多基因敲除 | 第28-44页 |
| 一、前言 | 第28-29页 |
| 二、实验材料与方法 | 第29-32页 |
| (一) 质粒构建 | 第29-30页 |
| (二) 细胞系转染 | 第30页 |
| (三) 人血T细胞的分离与培养 | 第30-31页 |
| (四) T7EN1酶切分析 | 第31页 |
| (五) T-A克隆测序 | 第31-32页 |
| 三、实验结果与分析 | 第32-44页 |
| (一) 针对T细胞检查点蛋白的sgRNA的细胞系验证 | 第32-38页 |
| (二) 串联sgRNA质粒可以提高编辑的效率 | 第38-40页 |
| (三) T细胞中实现多基因的敲除 | 第40-42页 |
| (四) 讨论 | 第42-44页 |
| 第三章 CRISPR-Cas9介导的PD-1敲除提高靶向CD133的CAR-T细胞的肿瘤杀伤能力 | 第44-65页 |
| 一、前言 | 第44-45页 |
| 二、实验材料与方法 | 第45-49页 |
| (一) 人血T细胞的分离与培养 | 第45页 |
| (二) 细胞系 | 第45页 |
| (三) 质粒构建 | 第45-46页 |
| (四) X射线辐照 | 第46页 |
| (五) T细胞电转与激活 | 第46页 |
| (六) T细胞快速扩增 | 第46-47页 |
| (七) 流式细胞检测 | 第47页 |
| (八) 细胞杀伤检测 | 第47-48页 |
| (九) 细胞因子检测 | 第48页 |
| (十) 细胞增殖检测 | 第48页 |
| (十一) 小鼠饲养与肿瘤治疗模型的建立 | 第48-49页 |
| 三、实验结果与分析 | 第49-65页 |
| (一) 使用CRISPR-Cas9技术进行PD-1敲除CD133 CAR-T细胞的制备 | 第49-50页 |
| (二) 使用CRISPR-Cas9与CD133 CAR的结合能够同时实现高效的敲除效率与CAR的表达 | 第50-53页 |
| (三) PD-1敲除增强CD133 CAR-T细胞在体外的抗肿瘤能力 | 第53-56页 |
| (四) PD-1敲除增强CD133 CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤能力 | 第56-58页 |
| (五)CRISPR-Cas9介导的PD-1敲除不影响CD133 CAR-T的安全性 | 第58-61页 |
| (六)讨论 | 第61-65页 |
| 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 发表文章 | 第80-83页 |
