| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第1章 文献综述 | 第11-23页 |
| 1.1 中国小麦花叶病毒（CWMV）的研究概况 | 第11-14页 |
| 1.1.1 CWMV的症状、传播介体及侵染循环 | 第11-12页 |
| 1.1.1.1 CWMV的田间症状 | 第11-12页 |
| 1.1.1.2 CWMV的传播介体及侵染循环 | 第12页 |
| 1.1.2 CWMV基因组结构及其编码蛋白 | 第12-14页 |
| 1.1.2.1 CWMV基因组结构 | 第12-13页 |
| 1.1.2.2 病毒复制酶（Viral Replicase） | 第13页 |
| 1.1.2.3 运动蛋白（MP） | 第13-14页 |
| 1.1.2.4 外壳蛋白及其相关蛋白 | 第14页 |
| 1.1.2.5 富含半胱氨酸蛋白（CRP） | 第14页 |
| 1.2 RNAi研究概况 | 第14-17页 |
| 1.2.1 RNAi的分类 | 第14-15页 |
| 1.2.2 RNAi的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.2.1 siRNA的作用机制 | 第15页 |
| 1.2.2.2 miRNA的作用机制 | 第15-16页 |
| 1.2.2.3 piRNA的作用机制 | 第16页 |
| 1.2.3 RNAi与抗病毒研究 | 第16页 |
| 1.2.4 vsiRNA的生物合成 | 第16-17页 |
| 1.2.5 CWMV的vsiRNA | 第17页 |
| 1.3 焦磷酸酶的功能研究 | 第17-21页 |
| 1.3.1 焦磷酸酶的生物学特性 | 第17-18页 |
| 1.3.2 质子泵焦磷酸酶的功能 | 第18-21页 |
| 1.3.2.1 H+质子泵功能 | 第18-19页 |
| 1.3.2.2 增强植物的抗逆性 | 第19-20页 |
| 1.3.2.3 影响生长素的极性运输 | 第20页 |
| 1.3.2.4 调控细胞质中PPi含量和植物异养生长 | 第20-21页 |
| 1.3.2.5 参与蔗糖的生物合成 | 第21页 |
| 1.4 本文研究的目的与意义 | 第21-23页 |
| 第2章 CWMV vsiRNA鉴定及其靶基因预测 | 第23-35页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料 | 第23页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第23页 |
| 2.2.2 主要试剂、培养基、仪器等 | 第23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-27页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第23-24页 |
| 2.3.2 提取Total RNA | 第24-25页 |
| 2.3.3 荧光定量PCR | 第25-26页 |
| 2.3.4 Northern-Blotting检测 | 第26-27页 |
| 2.3.4.1 提取Total RNA | 第26页 |
| 2.3.4.2 Total RNA的Northern-Blotting | 第26-27页 |
| 2.4 结果与分析 | 第27-32页 |
| 2.4.1 qRT-PCR鉴定CWMV来源的vsiRNA | 第27-29页 |
| 2.4.2 Northern-blotting鉴定CWMV来源的vsiRNA | 第29-30页 |
| 2.4.3 vsiRNA靶基因的预测 | 第30-31页 |
| 2.4.4 vsiRNA-20 及其靶基因TaVP的表达分析 | 第31-32页 |
| 2.5 小结与讨论 | 第32-35页 |
| 第3章 靶基因TaVP基因的克隆及vsiRNA-20 介导的切割 | 第35-57页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 材料 | 第35-36页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第35页 |
| 3.2.2 主要试剂、培养基、仪器等 | 第35-36页 |
| 3.3 实验方法 | 第36-50页 |
| 3.3.1 目的基因的扩增及纯化 | 第36-38页 |
| 3.3.1.1 引物设计 | 第36页 |
| 3.3.1.2 提取Total RNA | 第36页 |
| 3.3.1.3 RT-PCR | 第36页 |
| 3.3.1.4 PCR扩增 | 第36-37页 |
| 3.3.1.5 PCR产物检测及纯化 | 第37-38页 |
| 3.3.2 构建克隆载体 | 第38-40页 |
| 3.3.2.1 将目的片段连接T载体 | 第38页 |
| 3.3.2.2 连接产物转化大肠杆菌 | 第38页 |
| 3.3.2.3 鉴定筛选阳性克隆及测序 | 第38-39页 |
| 3.3.2.4 提取大肠杆菌的质粒 | 第39-40页 |
| 3.3.3 TaVP基因的 5’RACE分析 | 第40-43页 |
| 3.3.3.1 提取Total RNA | 第40-41页 |
| 3.3.3.2 TaVP基因 5’端扩增 | 第41-42页 |
| 3.3.3.3 构建克隆载体 | 第42-43页 |
| 3.3.4 TaVP基因的切割验证 | 第43-50页 |
| 3.3.4.1 引物设计 | 第43页 |
| 3.3.4.2 人工合成序列 | 第43-44页 |
| 3.3.4.3 克隆目的基因 | 第44页 |
| 3.3.4.4 LIC技术构建克隆载体 | 第44-46页 |
| 3.3.4.5 农杆菌感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| 3.3.4.6 将重组质粒转化至农杆菌感受态细胞中 | 第47页 |
| 3.3.4.7 农杆菌浸润接种 | 第47页 |
| 3.3.4.8 Western-Blotting检测GFP表达量 | 第47-48页 |
| 3.3.4.9 Northern-Blotting检测 | 第48-50页 |
| 3.4 结果与分析 | 第50-55页 |
| 3.4.1 全长TaVP cDNA扩增与克隆 | 第50页 |
| 3.4.2 TaVP基因同源核酸序列比对 | 第50-53页 |
| 3.4.3 5’RACE分析TaVP切割位点 | 第53页 |
| 3.4.4 vsiRNA-20 调控靶基因的表达功能分析 | 第53-55页 |
| 3.5 小结与讨论 | 第55-57页 |
| 第4章 靶基因TaVP与CWMV侵染之间的关系分析 | 第57-71页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 材料 | 第57-58页 |
| 4.2.5 实验材料 | 第57-58页 |
| 4.2.6 主要试剂、培养基、仪器等 | 第58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-64页 |
| 4.3.1 引物设计 | 第58页 |
| 4.3.2 构建烟草TRV VIGS载体 | 第58-60页 |
| 4.3.2.1 双酶切及连接反应 | 第58-59页 |
| 4.3.2.2 连接转化大肠杆菌 | 第59页 |
| 4.3.2.3 重组质粒电击转化农杆菌感受态细胞 | 第59-60页 |
| 4.3.2.4 农杆菌浸润 | 第60页 |
| 4.3.2.5 烟草中VIGS浸润 | 第60页 |
| 4.3.3 构建小麦BSMV VIGS载体 | 第60-63页 |
| 4.3.3.1 LIC技术构建VIGS载体 | 第60-62页 |
| 4.3.3.2 连接转化大肠杆菌 | 第62页 |
| 4.3.3.3 重组质粒电击转化至农杆菌感受态细胞 | 第62页 |
| 4.3.3.4 农杆菌浸润 | 第62-63页 |
| 4.3.3.5 烟草中VIGS浸润 | 第63页 |
| 4.3.3.6 病毒转染 | 第63页 |
| 4.3.4 小麦BSMV和CWMV RT-PCR检测 | 第63-64页 |
| 4.3.4.1 Total RNA提取及cDNA合成 | 第63页 |
| 4.3.4.2 RT-PCR检测 | 第63-64页 |
| 4.3.5 荧定量PCR | 第64页 |
| 4.3.6 Northern-Blotting检测 | 第64页 |
| 4.3.6.1 提取液法提取Total RNA | 第64页 |
| 4.3.6.2 Total RNA的Northern-Blotting | 第64页 |
| 4.4 结果与分析 | 第64-69页 |
| 4.4.1 在本氏烟中沉默NbVP基因与CWMV侵染之间的关系 | 第64-67页 |
| 4.4.2 在小麦中沉默TaVP基因与CWMV侵染之间的关系 | 第67-69页 |
| 4.5 小结与讨论 | 第69-71页 |
| 第5章 总结与展望 | 第71-73页 |
| 5.1 总结 | 第71页 |
| 5.2 展望 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-83页 |
| 附录 | 第83-93页 |
| 致谢 | 第93-95页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第95页 |
