| 摘要 | 第3-4页 |
| abstract | 第4页 |
| 中英文缩写与注释 | 第8-9页 |
| 1 文献综述 | 第9-18页 |
| 1.1 VB_6及其在生物体内的作用 | 第9-10页 |
| 1.2 PLP的生物合成途径 | 第10页 |
| 1.3 PNPO酶学研究进展 | 第10-11页 |
| 1.4 PNPO晶体结构研究进展 | 第11-15页 |
| 1.5 定点突变技术研究进展 | 第15-18页 |
| 2 引言 | 第18-19页 |
| 2.1 研究目的及意义 | 第18页 |
| 2.2 研究内容 | 第18页 |
| 2.3 课题来源 | 第18-19页 |
| 3 材料与方法 | 第19-29页 |
| 3.1 实验材料、主要试剂及设备 | 第19-21页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第19页 |
| 3.1.2 实验设备 | 第19页 |
| 3.1.3 酶与试剂 | 第19-20页 |
| 3.1.4 常用试剂配方 | 第20-21页 |
| 3.2 实验方法 | 第21-29页 |
| 3.2.1 突变点的选择 | 第21-22页 |
| 3.2.2 质粒的提取 | 第22-23页 |
| 3.2.3 定点突变 | 第23页 |
| 3.2.4 纯化PCR产物 | 第23-24页 |
| 3.2.5 PCR产物加A尾 | 第24页 |
| 3.2.6 PCR产物和T-载体的连接 | 第24页 |
| 3.2.7 DH5α、Rosetta感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 3.2.8 重组质粒的转化培养 | 第25页 |
| 3.2.9 重组子的鉴定 | 第25页 |
| 3.2.10 表达载体插入片段的获取 | 第25页 |
| 3.2.11 表达载体的构建 | 第25-26页 |
| 3.2.12 融合蛋白诱导表达 | 第26-27页 |
| 3.2.13 融合蛋白的纯化与浓缩 | 第27页 |
| 3.2.14 蛋白定量标准曲线的制作 | 第27-28页 |
| 3.2.15 体外酶促反应活性鉴定 | 第28页 |
| 3.2.16 生物信息学预测分析PNPO突变前后局部结构变化 | 第28-29页 |
| 4 结果与分析 | 第29-33页 |
| 4.1 突变体的获得 | 第29页 |
| 4.2 表达载体的获得 | 第29-30页 |
| 4.3 重组表达载体的诱导表达 | 第30页 |
| 4.4 表达蛋白酶促反应的分析 | 第30-31页 |
| 4.5 生物信息学预测 | 第31-33页 |
| 5 讨论 | 第33-35页 |
| 5.1 重叠延伸法定点突变 | 第33页 |
| 5.2 K111E和S160A突变 | 第33-35页 |
| 6 结论 | 第35-36页 |
| 6.1 构建突变重组质粒 | 第35页 |
| 6.2 体外酶活鉴定 | 第35-36页 |
| 参考文献 | 第36-39页 |
| 致谢 | 第39-40页 |
| 作者简介 | 第40页 |
| 成果清单 | 第40页 |