| 本文主要英文缩写词 | 第11-12页 |
| 摘要 | 第12-13页 |
| 第一部分 前言 | 第13-36页 |
| 第一章 乳铁蛋白及其小肽的研究进展 | 第14-23页 |
| 1 乳铁蛋白、N-lobe和Lfcin的分子结构 | 第14-16页 |
| 2 乳铁蛋白的生物学功能和作用机理 | 第16-19页 |
| 2.1 乳铁蛋白的结合功能 | 第16-17页 |
| 2.2 乳铁蛋白的抗病原微生物功能 | 第17-18页 |
| 2.3 乳铁蛋白的免疫调节功能 | 第18-19页 |
| 2.4 乳铁蛋白的抗氧化功能 | 第19页 |
| 2.5 乳铁蛋白的其它功能 | 第19页 |
| 3 乳铁蛋白肽的生物学功能 | 第19-21页 |
| 3.1 乳铁蛋白肽对细菌的作用 | 第19-20页 |
| 3.2 乳铁蛋白肽对真菌的作用 | 第20页 |
| 3.3 乳铁蛋白肽对病毒的作用 | 第20-21页 |
| 3.4 乳铁蛋白肽对内毒素的作用 | 第21页 |
| 3.5 乳铁蛋白肽的其它作用 | 第21页 |
| 4 乳铁蛋白及其小肽的国内外研究动态 | 第21-23页 |
| 第二章 酵母表达系统的研究进展 | 第23-34页 |
| 第一节 几种主要的酵母表达系统研究进展 | 第23-29页 |
| 1 酵母表达系统与其它表达系统的异同 | 第23-24页 |
| 2 酵母表达载体的结构 | 第24页 |
| 3 几种主要的酵母表达系统 | 第24-26页 |
| 3.1 酿酒酵母表达系统 | 第24-25页 |
| 3.2 甲醇营养型酵母表达系统 | 第25-26页 |
| 3.3 裂殖酵母表达系统 | 第26页 |
| 3.4 其它酵母表达系统 | 第26页 |
| 4 利用酵母表达外源基因的步骤及优化策略 | 第26-27页 |
| 5 几种酵母表达系统表达产物的糖基化特点 | 第27-28页 |
| 6 酵母表达系统的应用和展望 | 第28-29页 |
| 第二节 Pichia methanolica甲醇营养型酵母表达系统 | 第29-34页 |
| 1 P.methanolica系统的特点 | 第29-30页 |
| 2 P.methanolica的甲醇代谢机理 | 第30页 |
| 3 P.methanolica系统的表达宿主菌 | 第30-31页 |
| 4 P.methanolica的表达载体 | 第31页 |
| 5 表达载体与宿主菌的转化与整合 | 第31-32页 |
| 6 蛋白翻译后加工 | 第32页 |
| 7 利用P.methanolica系统表达外源基因的一般步骤 | 第32-33页 |
| 8 P.methanolica酵母的蛋白质分拣和区域化 | 第33页 |
| 9 P.methanolica表达系统的特点和应用前景 | 第33-34页 |
| 第三章 本课题的选题依据 | 第34-36页 |
| 1 研究乳铁蛋白N-叶的重要意义 | 第34-35页 |
| 2 选择P.methanolica表达系统表达PLF-N的原因 | 第35-36页 |
| 第二部分 研究内容 | 第36-78页 |
| 第一章 猪乳铁蛋白N-叶的基因克隆与序列分析 | 第37-47页 |
| 第一节 PLF基因的获得 | 第37-40页 |
| 1 材料与方法 | 第37-39页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第37页 |
| 1.1.1 动物组织 | 第37页 |
| 1.1.2 其它材料 | 第37页 |
| 1.1.3 试剂 | 第37页 |
| 1.2 方法 | 第37-39页 |
| 1.2.1 泌乳母猪乳腺组织的摘取 | 第37-38页 |
| 1.2.2 母猪乳腺细胞总RNA的提取 | 第38页 |
| 1.2.3 反转录 | 第38页 |
| 1.2.4 引物设计 | 第38页 |
| 1.2.5 PCR扩增 | 第38-39页 |
| 2 结果 | 第39页 |
| 3 讨论 | 第39-40页 |
| 第二节 猪乳铁蛋白N-叶基因的克隆和测序 | 第40-47页 |
| 1 材料与方法 | 第40-44页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第40-41页 |
| 1.1.1 基因片段 | 第40页 |
| 1.1.2 质粒和菌株 | 第40页 |
| 1.1.3 试剂 | 第40-41页 |
| 1.2 方法 | 第41-44页 |
| 1.2.1 PLF-N基因的克隆 | 第41页 |
| 1.2.2 目的片段与载体连接 | 第41-42页 |
| 1.2.3 CaCl_2法制备E.coli TG1感受态细胞(CaCl_2法) | 第42页 |
| 1.2.4 制作含X-gal和IPTG的筛选培养基 | 第42页 |
| 1.2.5 连接产物转化E.coli TG1感受态细胞 | 第42页 |
| 1.2.6 鉴定重组质粒 | 第42-43页 |
| 1.2.7 阳性质粒的抽提 | 第43页 |
| 1.2.8 阳性转化子制作甘油菌并测序 | 第43-44页 |
| 2 结果 | 第44-46页 |
| 2.1 重组质粒的酶切鉴定 | 第44页 |
| 2.2 pGEM-PLF-N的测序结果 | 第44-46页 |
| 3 讨论 | 第46-47页 |
| 第二章 猪乳铁蛋白N-叶基因的大肠杆菌表达 | 第47-56页 |
| 第一节 重组大肠杆菌表达载体的构建 | 第47-51页 |
| 1 材料与方法 | 第47-49页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第47页 |
| 1.1.1 菌株和质粒 | 第47页 |
| 1.1.2 试剂 | 第47页 |
| 1.2 方法 | 第47-49页 |
| 1.2.1 BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ消化pGEM-PLF-N | 第47-48页 |
| 1.2.2 玻璃珠法回收1kb片段 | 第48页 |
| 1.2.3 BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ消化pET-28a(+) | 第48页 |
| 1.2.4 BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ消化的PLF-N连接BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ消化的pET-28a(+) | 第48-49页 |
| 1.2.5 TG1感受态细胞的制备、转化、阳性转化子的筛选 | 第49页 |
| 1.2.6 碱法小量抽提质粒并用BamH Ⅰ／EcoR Ⅰ双酶切鉴定 | 第49页 |
| 2 结果与讨论 | 第49-51页 |
| 2.1 重组表达载体的构建策略 | 第49页 |
| 2.2 重组表达载体的酶切鉴定 | 第49-51页 |
| 第二节 PLF-N基因的大肠杆菌表达 | 第51-56页 |
| 1 材料与方法 | 第51-54页 |
| 1.1 材料 | 第51页 |
| 1.2 试剂与药品 | 第51-53页 |
| 1.2.1 药品 | 第51页 |
| 1.2.2 试剂 | 第51-53页 |
| 1.3 方法 | 第53-54页 |
| 1.3.1 PLF-N基因在大肠肝菌中的表达 | 第53页 |
| 1.3.2 表达产物的SDS-PAGE | 第53页 |
| 1.3.3 表达产物的Western Blot检测 | 第53-54页 |
| 2 结果与讨论 | 第54-56页 |
| 2.1 大肠杆菌重组表达产物SDS-PAGE分析结果 | 第54页 |
| 2.2 大肠杆菌重组表达产物的Western Blot鉴定结果 | 第54-55页 |
| 2.3 讨论 | 第55-56页 |
| 第三章 猪乳铁蛋白N-叶的酵母表达 | 第56-78页 |
| 第一节 重组酵母表达载体的构建 | 第56-62页 |
| 1 材料与方法 | 第56-58页 |
| 1.1 材料 | 第56页 |
| 1.1.1 质粒与菌株 | 第56页 |
| 1.1.2 其它试剂 | 第56页 |
| 1.2 方法 | 第56-58页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第56页 |
| 1.2.2 PCR扩增PLF-N基因 | 第56-57页 |
| 1.2.3 载体和基因片段的酶切消化 | 第57页 |
| 1.2.4 玻璃珠法回收PLF-N基因 | 第57页 |
| 1.2.5 目的片段与载体连接 | 第57页 |
| 1.2.6 DH5α感受态细胞的制备、转化、阳性转化子的筛选 | 第57页 |
| 1.2.7 碱法小量抽提质粒并用PCR方法鉴定 | 第57-58页 |
| 1.2.8 阳性转化子制做甘油菌测序和保存 | 第58页 |
| 2 结果与讨论 | 第58-62页 |
| 2.1 重组表达载体的构建策略 | 第58-59页 |
| 2.2 阳性克隆的PCR鉴定结果 | 第59页 |
| 2.3 DNA测序结果 | 第59页 |
| 2.4 讨论 | 第59-62页 |
| 第二节 PLF-N的P.methanolica表达 | 第62-74页 |
| 1 材料与方法 | 第62-69页 |
| 1.1 试剂与药品 | 第62-64页 |
| 1.1.1 药品 | 第62页 |
| 1.1.2 试剂 | 第62-64页 |
| 1.2 方法 | 第64-69页 |
| 1.2.1 大量抽提质粒 | 第64-65页 |
| 1.2.2 载体的线性化 | 第65页 |
| 1.2.3 PMAD11感受态细胞的制备 | 第65-66页 |
| 1.2.4 电转化 | 第66-67页 |
| 1.2.5 筛选高水平表达的重组子 | 第67页 |
| 1.2.6 酵母基因组的提取 | 第67页 |
| 1.2.7 阳性重组子的PCR鉴定 | 第67-68页 |
| 1.2.8 诱导表达 | 第68页 |
| 1.2.9 表达产物SDS-PAGE与Western Blot分析 | 第68-69页 |
| 1.2.9.1 细胞样品的准备 | 第68页 |
| 1.2.9.2 培养基样品的准备 | 第68页 |
| 1.2.9.3 SDS-PAGE分析 | 第68-69页 |
| 1.2.9.4 Western Blot分析 | 第69页 |
| 2 结果与讨论 | 第69-74页 |
| 2.1 Ade~(?)转化子的筛选结果 | 第69页 |
| 2.2 高水平表达目的蛋白的Ade~(?)转化子的筛选结果 | 第69-70页 |
| 2.3 酵母基因组的琼脂糖凝胶电泳结果 | 第70-71页 |
| 2.4 PCR筛选阳性重组子的结果 | 第71页 |
| 2.5 SDS-PAGE检测和Western Blot分析 | 第71-74页 |
| 第三节 重组表达产物对大肠杆菌的表达效果研究 | 第74-78页 |
| 1 材料与方法 | 第74-75页 |
| 1.1 材料 | 第74页 |
| 1.1.1 菌株 | 第74页 |
| 1.1.2 抗生素 | 第74页 |
| 1.1.3 培养基 | 第74页 |
| 1.2 方法 | 第74-75页 |
| 2 结果与讨论 | 第75-78页 |
| 2.1 结果 | 第75-76页 |
| 2.2 讨论 | 第76-78页 |
| 小结 | 第78-79页 |
| 附录1. PET-28A(+)的质粒图谱和MCS序列 | 第79-80页 |
| 附录2. PMET表达载体的质粒图谱和MCS序列 | 第80-81页 |
| 附录3. DNA测序结果 | 第81-83页 |
| 参考文献 | 第83-91页 |
| ABSTRACT | 第91页 |
