| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 1 引言 | 第12-32页 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒的研究 | 第14-18页 |
| 1.1.1 PRSV的发现与地区分布 | 第14-15页 |
| 1.1.2 PRSV的病症与传播途径 | 第15页 |
| 1.1.3 PRSV的寄主范围与生物型 | 第15-16页 |
| 1.1.4 PRSV的生物学特征及基因结构与功能 | 第16-18页 |
| 1.2 番木瓜畸形花叶病毒的研究 | 第18-20页 |
| 1.2.1. PLDMV的发现与地区分布 | 第18页 |
| 1.2.2. PLDMV的病症与传播途径 | 第18-19页 |
| 1.2.3. PLDMV的寄主范围与生物型 | 第19页 |
| 1.2.4. PLDMV的生物学特征及基因结构 | 第19-20页 |
| 1.3 番木瓜花叶病毒的研究 | 第20-22页 |
| 1.3.1. PaMV的发现与地区分布 | 第20-21页 |
| 1.3.2. PaMV的病症与传播途径 | 第21页 |
| 1.3.3. PaMV的寄主范围及生物学特征 | 第21-22页 |
| 1.4 植物病毒的检测方法 | 第22-26页 |
| 1.4.1. 生物学检测法 | 第22-23页 |
| 1.4.2. 形态学检测法 | 第23页 |
| 1.4.3. 免疫学检测法 | 第23-24页 |
| 1.4.4. 分子生物学检测法 | 第24-26页 |
| 1.5 全长cDNA侵染性克隆研究进展 | 第26-32页 |
| 1.5.1. 体外转录cDNA侵染性克隆 | 第27-29页 |
| 1.5.2. 体内转录cDNA侵染性克隆 | 第29-32页 |
| 2 材料与方法 | 第32-71页 |
| 2.1 材料 | 第32-41页 |
| 2.1.1 植物材料和病毒株 | 第32页 |
| 2.1.2 试剂 | 第32页 |
| 2.1.3 菌株及载体 | 第32-34页 |
| 2.1.4 培养基及主要试剂配方 | 第34-36页 |
| 2.1.5 引物 | 第36-41页 |
| 2.2 方法 | 第41-71页 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取及纯度检测 | 第41页 |
| 2.2.2 机械摩擦接种PLDMV及体外转录产物 | 第41-42页 |
| 2.2.3 酵母感受态细胞的制备、转化及质粒提取 | 第42-43页 |
| 2.2.4 农杆菌化学转化感受态细胞的制备及转化 | 第43-44页 |
| 2.2.5 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、回收、T/A克隆及测序与数据分析 | 第44-46页 |
| 2.2.6 cDNA第一链的合成及3'RACE | 第46-47页 |
| 2.2.7 5'RACE | 第47-50页 |
| 2.2.8 In-Fusion反应 | 第50-51页 |
| 2.2.9 番木瓜叶片总DNA和总蛋白的提取 | 第51-52页 |
| 2.2.10 Western blot分析检测GFP表达 | 第52-53页 |
| 2.2.11 番木瓜叶肉原生质体的分离及转化 | 第53-54页 |
| 2.2.12 PLDMV的鉴定及病症表现 | 第54-55页 |
| 2.2.13 PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 | 第55-57页 |
| 2.2.14 PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 | 第57-58页 |
| 2.2.15 构建体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆pT7-FL | 第58-59页 |
| 2.2.16 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第59-60页 |
| 2.2.17 体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 | 第60-62页 |
| 2.2.18 酵母重组系统构建体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第62-64页 |
| 2.2.19 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆侵染性分析 | 第64-65页 |
| 2.2.20 酵母重组系统构建PLDMV-DF表达GFP的病毒表达载体 | 第65-67页 |
| 2.2.21 PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 | 第67-68页 |
| 2.2.22 植物ihpRNA表达载体在番木瓜原生质体中沉默效果的验证 | 第68-71页 |
| 3 结果与分析 | 第71-140页 |
| 3.1. PLDMV的发现与病症 | 第71-74页 |
| 3.1.1 番木瓜叶片总RNA的质量检测 | 第71页 |
| 3.1.2 PLDMV的鉴定发现 | 第71-73页 |
| 3.1.3 PLDMV-DF在番木瓜、西葫芦及本生烟草上的病症表现 | 第73-74页 |
| 3.2. PLDMV-DF分离物全长基因组序列的测定 | 第74-77页 |
| 3.2.1. 构建pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E和pMD-F | 第75-76页 |
| 3.2.2. 5'/3'RACE及质粒pMD-5R和pMD-3R的构建 | 第76-77页 |
| 3.3. PLDMV-DF分离物全长基因组的结构分析 | 第77-81页 |
| 3.3.1. PLDMV-DF分离物全长基因组的序列和ORF结构分析 | 第77页 |
| 3.3.2. PLDMV-DF分离物ORF编码的多聚蛋白酶切位点分析 | 第77-78页 |
| 3.3.3. PLDMV-DF分离物的全长核苷酸和氨基酸的相似性分析 | 第78-80页 |
| 3.3.4. PLDMV-DF与Taiwan-CZ、Taiwan-KS、Japan-J56P进化树分析 | 第80-81页 |
| 3.4. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 | 第81-91页 |
| 3.4.1. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP引物设计 | 第81-85页 |
| 3.4.2. PRSV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 | 第85页 |
| 3.4.3. PLDMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 | 第85-86页 |
| 3.4.4. PaMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 | 第86页 |
| 3.4.5. PLDMV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 | 第86-88页 |
| 3.4.6. PRSV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 | 第88-91页 |
| 3.4.7. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP的特异性检测 | 第91页 |
| 3.5. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 | 第91-95页 |
| 3.5.1. 引物的特异性及多重RT-PCR最适引物对的筛选 | 第91-92页 |
| 3.5.2. 单一RT-PCR和多重RT-PCR反应体系及条件的优化 | 第92-94页 |
| 3.5.3. 单一PCR和多重PCR的灵敏度检测 | 第94页 |
| 3.5.4. 单一RT-PCR和多重RT-PCR对田间样品的检测应用 | 第94-95页 |
| 3.6. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第95-100页 |
| 3.6.1. 构建pMD-AB、pMD-CD、pMD-EF、pGEM-ABC和pGEM-DEF | 第96-97页 |
| 3.6.2. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第97-100页 |
| 3.7. 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第100-106页 |
| 3.7.1. 马铃薯ST-LS1和菜豆NiR基因的内含子序列测定 | 第100-102页 |
| 3.7.2. 构建含intron 2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第102-103页 |
| 3.7.3. 构建含intron IV2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第103-105页 |
| 3.7.4. 构建含intron2/IV2体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第105-106页 |
| 3.8. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 | 第106-111页 |
| 3.8.1. PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的体外转录 | 第106-107页 |
| 3.8.2. 体外转录侵染性克隆的体外转录物接种与症状表现 | 第107-108页 |
| 3.8.3. 体外转录侵染性克隆体外转录物接种后的RT-PCR检测 | 第108-110页 |
| 3.8.4. 侵染性克隆pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2侵染后的内含子检测 | 第110-111页 |
| 3.9. 酵母重组系统构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第111-115页 |
| 3.9.1. 构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第111-113页 |
| 3.9.2. 构建含intron 2的体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 | 第113-115页 |
| 3.10. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 | 第115-120页 |
| 3.10.1. PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体的构建 | 第115-116页 |
| 3.10.2. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种与症状表现 | 第116-118页 |
| 3.10.3. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种后RT-PCR检测及侵染效率 | 第118-120页 |
| 3.11. 酵母重组系统构建PLDMV-DF的病毒表达载体 | 第120-126页 |
| 3.11.1. 构建PLDMV-DF的P1/HC-Pro之间插入GFP的病毒表达载体 | 第120-124页 |
| 3.11.2. 构建PLDMV-DF的NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体 | 第124-126页 |
| 3.12. PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 | 第126-137页 |
| 3.12.1. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种与症状表现 | 第126-128页 |
| 3.12.2. PLDMV-DF病毒表达载体接种后的RT-PCR检测及侵染效率 | 第128-131页 |
| 3.12.3. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种后GFP荧光检测 | 第131-135页 |
| 3.12.4. PLDMV-DF病毒表达载体的western blot分析 | 第135-137页 |
| 3.13. 4种不同长度CP基因植物ihpRNA表达载体的构建 | 第137-138页 |
| 3.14. 植物ihpRNA表达载体沉默效率的检测 | 第138-140页 |
| 4 讨论 | 第140-151页 |
| 4.1. 番木瓜畸形花叶病毒海南东方分离物的鉴定 | 第140-141页 |
| 4.2. PLDMV-DF全长基因组序列的测定与解析 | 第141-142页 |
| 4.3. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 | 第142页 |
| 4.4. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 | 第142-143页 |
| 4.5. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与侵染性分析 | 第143-145页 |
| 4.5.1. 无内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 | 第143-144页 |
| 4.5.2. 含内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 | 第144-145页 |
| 4.6. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆与侵染性分析 | 第145-147页 |
| 4.7. 插入外源gfp报告基因的PLDMV-DF病毒表达载体的构建与表达 | 第147-150页 |
| 4.7.1. 在P1/HC-Pro之间插入gfp的病毒表达载体的构建与表达分析 | 第147-149页 |
| 4.7.2. 在NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体的构建与表达分析 | 第149-150页 |
| 4.8. 用GFP的病毒表达载体在原生质体中验证ihpRNA载体的沉默效率 | 第150-151页 |
| 研究结论 | 第151-152页 |
| 参考文献 | 第152-163页 |
| 附录 | 第163-168页 |
| 致谢 | 第168页 |
