| 摘要 | 第5-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 绪论 | 第12-26页 |
| 1.1 尿酸 | 第12-15页 |
| 1.1.1 尿酸的产生 | 第12-13页 |
| 1.1.2 尿酸与疾病 | 第13-15页 |
| 1.1.2.1 尿酸与痛风 | 第13页 |
| 1.1.2.2 尿酸与心血管疾病 | 第13-14页 |
| 1.1.2.3 尿酸与肾脏疾病 | 第14页 |
| 1.1.2.4 尿酸与糖尿病 | 第14页 |
| 1.1.2.5 尿酸与代谢综合征 | 第14-15页 |
| 1.1.3 尿酸的检测 | 第15页 |
| 1.2 尿酸氧化酶 | 第15-20页 |
| 1.2.1 尿酸氧化酶概况 | 第15-16页 |
| 1.2.2 尿酸氧化酶的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.3 人体中的尿酸氧化酶基因及其在进化上的意义 | 第17页 |
| 1.2.4 尿酸氧化酶的结构 | 第17-18页 |
| 1.2.5 尿酸氧化酶的研究意义 | 第18-20页 |
| 1.2.5.1 尿酸氧化酶的应用 | 第18页 |
| 1.2.5.2 多种促进尿酸分解药物的比较 | 第18-19页 |
| 1.2.5.3 尿酸氧化酶在临床上的使用 | 第19-20页 |
| 1.2.5.4 尿酸氧化酶研究中存在的问题 | 第20页 |
| 1.3 定向进化 | 第20-26页 |
| 1.3.1 蛋白质工程 | 第20-21页 |
| 1.3.2 定向进化 | 第21-26页 |
| 1.3.2.1 定向进化的实验设计 | 第21-22页 |
| 1.3.2.2 定向进化的突变方法 | 第22-24页 |
| 1.3.2.3 定向进化的筛选方法 | 第24页 |
| 1.3.2.4 定向进化的实际应用 | 第24-26页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第26-58页 |
| 2.1 实验材料 | 第26-29页 |
| 2.1.1 实验用菌株与载体 | 第26页 |
| 2.1.2 实验用酶与化学试剂 | 第26页 |
| 2.1.2.1 酶 | 第26页 |
| 2.1.2.2 化学试剂 | 第26页 |
| 2.1.3 培养基与溶液的配制 | 第26-28页 |
| 2.1.4 实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-58页 |
| 2.2.1 PCR扩增尿酸氧化酶基因 | 第29-30页 |
| 2.2.2 PCR产物的回收 | 第30-32页 |
| 2.2.3 双酶切基因和质粒 | 第32页 |
| 2.2.4 连接基因和载体 | 第32-33页 |
| 2.2.5 乙醇沉淀处理连接产物 | 第33页 |
| 2.2.6 电转化连接产物 | 第33-35页 |
| 2.2.7 核酸的琼脂糖凝胶电泳 | 第35页 |
| 2.2.8 质粒抽提 | 第35-36页 |
| 2.2.9 尿酸氧化酶在大肠杆菌中的异源表达 | 第36-38页 |
| 2.2.9.1 探讨表达时间长短对蛋白表达的影响 | 第36-37页 |
| 2.2.9.2 探讨诱导剂浓度对蛋白表达的影响 | 第37页 |
| 2.2.9.3 大量诱导表达尿酸氧化酶 | 第37-38页 |
| 2.2.10 纯化异源表达的尿酸氧化酶 | 第38-39页 |
| 2.2.11 SDS-PAGE电泳检测蛋白 | 第39-40页 |
| 2.2.12 FPLC | 第40-41页 |
| 2.2.13 蛋白浓缩和结晶 | 第41-43页 |
| 2.2.14 尿酸氧化酶活性检测方法 | 第43-45页 |
| 2.2.15 探讨咪唑对酶活力单位是否有影响 | 第45-46页 |
| 2.2.16 尿酸氧化酶理化性质的鉴定 | 第46-49页 |
| 2.2.17 突变库的构建方法 | 第49-55页 |
| 2.2.18 突变库的筛选方法 | 第55-58页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第58-100页 |
| 3.1 重组质粒的构建与表达 | 第58页 |
| 3.2 尿酸氧化酶蛋白表达条件的选择 | 第58-60页 |
| 3.2.1 探讨尿酸氧化酶的诱导剂浓度 | 第58-59页 |
| 3.2.2 探讨尿酸氧化酶的诱导时间 | 第59-60页 |
| 3.3 突变库的筛选 | 第60-72页 |
| 3.3.1 线路1的突变体 | 第60-66页 |
| 3.3.1.1 第一轮尿酸氧化酶的定向进化 | 第60-61页 |
| 3.3.1.2 第二轮筛选获得的突变体 | 第61-62页 |
| 3.3.1.3 重组第二轮得到的突变体 | 第62-63页 |
| 3.3.1.4 第四、第五轮突变体的筛选 | 第63-64页 |
| 3.3.1.5 第六轮突变体的筛选 | 第64-65页 |
| 3.3.1.6 以6E9为模板的突变库的筛选 | 第65-66页 |
| 3.3.2 线路2的突变体 | 第66-71页 |
| 3.3.2.1 线路2的第三轮突变体筛选 | 第66-67页 |
| 3.3.2.2 线路2的第四轮突变体筛选 | 第67-69页 |
| 3.3.2.3 线路2的第五、六轮突变体筛选 | 第69-70页 |
| 3.3.2.4 以6D9为模板的突变库筛选 | 第70-71页 |
| 3.3.3 尿酸氧化酶定向进化小结 | 第71-72页 |
| 3.4 突变体酶活力单位检测 | 第72-75页 |
| 3.4.1 突变体酶活力单位检测 | 第72-74页 |
| 3.4.2 黄曲霉来源的尿酸氧化酶酶活力单位检测 | 第74-75页 |
| 3.5 突变体理化性质的鉴定 | 第75-78页 |
| 3.5.1 最适温度的比较 | 第75-76页 |
| 3.5.2 热稳定性的比较 | 第76-77页 |
| 3.5.3 最适pH的比较 | 第77页 |
| 3.5.4 pH稳定性比较 | 第77-78页 |
| 3.6 突变位点对酶活力单位的影响 | 第78-81页 |
| 3.7 动力学参数的测定 | 第81-84页 |
| 3.8 尿酸氧化酶的模拟结构 | 第84-89页 |
| 3.9 尿酸氧化酶的晶体结构 | 第89-97页 |
| 3.9.1 尿酸氧化酶的纯化 | 第89-90页 |
| 3.9.2 FPLC | 第90-91页 |
| 3.9.3 尿酸氧化酶的浓缩与结晶 | 第91页 |
| 3.9.4 截短的尿酸氧化酶质粒的构建 | 第91-93页 |
| 3.9.5 诱导表达并纯化截短的尿酸氧化酶 | 第93-94页 |
| 3.9.6 WT310和DQ310结晶与衍射 | 第94页 |
| 3.9.7 晶体结构解析 | 第94-97页 |
| 3.10 结论与展望 | 第97-100页 |
| 参考文献 | 第100-108页 |
| 附录 | 第108-112页 |
| 致谢 | 第112-114页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 | 第114页 |