| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 前言 | 第15-43页 |
| 1.1 引言 | 第15页 |
| 1.2 细小病毒科简介 | 第15-17页 |
| 1.3 人博卡病毒简介 | 第17-25页 |
| 1.3.1 人博卡病毒的生物特性及诊断方法 | 第17-19页 |
| 1.3.2 人博卡病毒的流行病学特性 | 第19-21页 |
| 1.3.3 人博卡病毒与其他病毒共感染的特性 | 第21-22页 |
| 1.3.4 人博卡病毒感染的临床症状 | 第22-25页 |
| 1.4 人博卡病毒的分子生物学特性 | 第25-32页 |
| 1.4.1 人博卡病毒基因组特征 | 第25-28页 |
| 1.4.2 人博卡病毒转录翻译机制研究 | 第28-29页 |
| 1.4.3 人博卡病毒蛋白基因功能研究 | 第29-32页 |
| 1.5 细小病毒与细胞死亡及细胞阻滞 | 第32-37页 |
| 1.5.1 红细胞病毒属—B19 | 第33-34页 |
| 1.5.2 博卡病毒属—HBoV、MVC、BPV | 第34-35页 |
| 1.5.3 水貂阿留申病病毒属—AMDV | 第35页 |
| 1.5.4 依赖病毒属—AAV | 第35-36页 |
| 1.5.5 细小病毒属—MVM、H-1PV | 第36-37页 |
| 1.6 细胞转录因子及炎症因子 | 第37-39页 |
| 1.6.1 NF-κB | 第37页 |
| 1.6.2 STAT家族 | 第37-38页 |
| 1.6.3 AP-1 | 第38页 |
| 1.6.4 TNF-α | 第38-39页 |
| 1.6.5 IL-6 | 第39页 |
| 1.7 CHECKMATE~(TM)哺乳动物双杂交系统简介 | 第39-40页 |
| 1.8 T7噬菌体展示技术简介 | 第40-42页 |
| 1.9 研究目的和意义 | 第42-43页 |
| 第二章 人博卡病毒非结构蛋白NPl诱导HELA细胞阻滞及细胞凋亡 | 第43-64页 |
| 2.1 材料与方法 | 第43-49页 |
| 2.1.1 载体、菌株与细胞系 | 第43页 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 | 第43-44页 |
| 2.1.3 重组表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| 2.1.4 转染(脂质体介导转染法) | 第45-46页 |
| 2.1.5 免疫荧光与Western blotting | 第46页 |
| 2.1.6 DAPI与JC-1染色 | 第46-47页 |
| 2.1.7 流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期 | 第47页 |
| 2.1.8 酶活性分析 | 第47-49页 |
| 2.2 实验结果 | 第49-61页 |
| 2.2.1 目的蛋白NP1在Hela细胞中表达 | 第49-50页 |
| 2.2.2 NP1诱导Hela细胞周期阻滞和细胞凋亡 | 第50-54页 |
| 2.2.3 NP1诱导细胞依赖于caspase活性的细胞凋亡 | 第54-57页 |
| 2.2.4 NP1通过线粒体途径诱导细胞凋亡 | 第57-58页 |
| 2.2.5 NP1的N末端对细胞凋亡起至关重要的作用 | 第58-61页 |
| 2.3 讨论 | 第61-64页 |
| 第三章 人博卡病毒非结构蛋白对细胞转录因子调控分析 | 第64-78页 |
| 3.1 材料和方法 | 第64-69页 |
| 3.1.1 材料 | 第64-66页 |
| 3.1.2 重组表达质粒的构建 | 第66-67页 |
| 3.1.3 免疫荧光和Western blot分析 | 第67页 |
| 3.1.4 荧光素酶双报告基因活性测定 | 第67页 |
| 3.1.5 ELISA和实时荧光定量PCR检测IL6和TNF-α的表达 | 第67-68页 |
| 3.1.6 哺乳动物双杂交实验 | 第68页 |
| 3.1.7 统计学分析 | 第68-69页 |
| 3.2 结果 | 第69-75页 |
| 3.2.1 重组表达载体的构建 | 第69页 |
| 3.2.2 目的蛋白在293T细胞中的表达 | 第69-70页 |
| 3.2.3 HBoV1 NP1上调转录因子AP-1、STAT3及STATl的活性,对NF-κB活性无影响 | 第70-72页 |
| 3.2.4 NP1对炎症因子IL-6和TNF-α表达的影响 | 第72-73页 |
| 3.2.5 单独表达的NP1蛋白不存在自身相互作用 | 第73-74页 |
| 3.2.6 HBoV1 NS1上调转录因子AP-1、STAT3及NF-κB的活性,对STAT1活性无影响 | 第74-75页 |
| 3.3 讨论 | 第75-78页 |
| 第四章 人博卡病毒非结构蛋白NP1核定位信号分析 | 第78-94页 |
| 4.1 材料和方法 | 第79-82页 |
| 4.1.1 材料 | 第79页 |
| 4.1.2 重组表达质粒的构建 | 第79-81页 |
| 4.1.3 转染、荧光显微镜观察 | 第81-82页 |
| 4.1.4 免疫荧光与Western blotting | 第82页 |
| 4.2 实验结果 | 第82-92页 |
| 4.2.1 NP1融合蛋白的表达及细胞定位 | 第82-84页 |
| 4.2.2 NP1 C末端和两端截短定位情况 | 第84-86页 |
| 4.2.3 NP1 N末端截短蛋白在细胞中的定位 | 第86-90页 |
| 4.2.4 NP1突变蛋白定位情况 | 第90-92页 |
| 4.3 讨论 | 第92-94页 |
| 第五章 人博卡病毒非结构蛋白NP1与宿主细胞相互作用蛋白筛选 | 第94-107页 |
| 5.1 材料和方法 | 第94-98页 |
| 5.1.1 材料 | 第94-95页 |
| 5.1.2 引物的设计及合成 | 第95页 |
| 5.1.3 原核表达载体的构建 | 第95页 |
| 5.1.4 pMAL-NP1的诱导表达及条件优化 | 第95页 |
| 5.1.5 融合蛋白MBP-NP1的纯化 | 第95-96页 |
| 5.1.6 BCA法测定蛋白浓度(碧云天试剂盒) | 第96页 |
| 5.1.7 T7噬菌体文库扩增及空斑测定噬菌体滴度 | 第96-97页 |
| 5.1.8 噬菌体的生物筛选 | 第97页 |
| 5.1.9 竞争性洗脱特异性结合的噬菌体 | 第97页 |
| 5.1.10 噬斑的PCR扩增 | 第97-98页 |
| 5.1.11 克隆载体的构建和鉴定 | 第98页 |
| 5.1.12 DNA序列测序及同源性比对 | 第98页 |
| 5.2 实验结果 | 第98-105页 |
| 5.2.1 融合蛋白MBP-NP1的诱导表达及条件优化 | 第98-100页 |
| 5.2.2 融合蛋白MBP-NP1的纯化 | 第100-102页 |
| 5.2.3 扩增后T7人肝cDNA文库多样性分析 | 第102页 |
| 5.2.4 噬菌体生物淘选结果 | 第102-103页 |
| 5.2.5 目的基因PCR扩增、序列比对及同源性分析 | 第103-104页 |
| 5.2.6 测序数据分析 | 第104-105页 |
| 5.3 讨论 | 第105-107页 |
| 结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-127页 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 | 第127-128页 |
| 致谢 | 第128页 |
