| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第一章 绪论 | 第8-17页 |
| 1.1 丁醇概述 | 第8-13页 |
| 1.1.1 丁醇的特征及应用 | 第8页 |
| 1.1.2 丁醇的生产方式 | 第8-9页 |
| 1.1.3 梭菌发酵生产丁醇的国内外研究 | 第9页 |
| 1.1.4 微生物发酵生产丁醇的代谢途径 | 第9-11页 |
| 1.1.5 代谢工程菌的构建及其发酵生产丁醇的研究进展 | 第11-13页 |
| 1.2 本研究采用的重组大肠杆菌的改造方法 | 第13-14页 |
| 1.2.1 Red同源重组法 | 第13-14页 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas基因编辑法 | 第14页 |
| 1.3 本课题的研究意义和目标 | 第14-17页 |
| 1.3.1 基金来源 | 第14页 |
| 1.3.2 研究意义 | 第14-15页 |
| 1.3.3 研究目标及主要研究内容 | 第15-17页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第17-25页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第17-18页 |
| 2.1.2 实验仪器设备和试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.3 实验所用引物 | 第19页 |
| 2.1.4 培养基及缓冲液 | 第19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-25页 |
| 2.2.1 丁醇生产途径关键基因thl A的替代 | 第19-21页 |
| 2.2.2 产代谢副产物的支路途径相关基因的敲除 | 第21-22页 |
| 2.2.3 辅酶NADH及乙酰辅酶A再生相关基因的过表达 | 第22页 |
| 2.2.4 基因组整合 | 第22-24页 |
| 2.2.5 发酵过程优化 | 第24-25页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第25-44页 |
| 3.1 丁醇合成途径关键基因thl A的替代 | 第25-28页 |
| 3.1.1 E. coli. JM109 (DE3)的基因组提取 | 第25-26页 |
| 3.1.2 ato B，ato DAEB和ato BDA基因片段的扩增 | 第26页 |
| 3.1.3 线性化载体的制备 | 第26页 |
| 3.1.4 连接及验证 | 第26-27页 |
| 3.1.5 基因替换后的重组菌发酵产物分析 | 第27-28页 |
| 3.2 产代谢副产物的支路途径相关基因的敲除 | 第28-32页 |
| 3.2.1 打靶片段的扩增 | 第29页 |
| 3.2.2 pKD46质粒的导入 | 第29页 |
| 3.2.3 电转化及验证 | 第29-30页 |
| 3.2.4 抗性消除 | 第30-31页 |
| 3.2.5 敲除菌的发酵产物分析 | 第31-32页 |
| 3.3 辅酶NADH及乙酰辅酶A再生相关基因的表达 | 第32-34页 |
| 3.3.1 目的片段扩增及载体制备 | 第32-33页 |
| 3.3.2 一步克隆连接并验证 | 第33页 |
| 3.3.3 发酵产物分析 | 第33-34页 |
| 3.4 基因组整合 | 第34-38页 |
| 3.4.1 pTargetF-sgRNA的构建 | 第34-35页 |
| 3.4.2 带同源臂的片段构建 | 第35页 |
| 3.4.3 电转及验证 | 第35-36页 |
| 3.4.4 基因组整合后的重组菌的发酵验证 | 第36页 |
| 3.4.5 基因组整合菌株发酵产丁醇的研究 | 第36-38页 |
| 3.5 发酵过程的优化 | 第38-44页 |
| 3.5.1 接种策略的优化 | 第38-39页 |
| 3.5.2 发酵温度的优化 | 第39-40页 |
| 3.5.3 诱导剂浓度的优化 | 第40页 |
| 3.5.4 发酵起始菌浓的优化 | 第40-41页 |
| 3.5.5 丁酸补加 | 第41-42页 |
| 3.5.6 利用优化的发酵条件进行丁醇生产 | 第42-44页 |
| 主要结论与展望 | 第44-46页 |
| 致谢 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-53页 |
| 附录 | 第53-57页 |
| 附录 1：本研究所用的引物 | 第53-55页 |
| 附录 2：糖浓度标准曲线 | 第55-56页 |
| 附录 3：溶剂标准曲线 | 第56-57页 |
| 附录 4：作者在硕士学位期间发表的论文 | 第57页 |
