| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 引言 | 第14-23页 |
| 1 动物支原体病的研究进展 | 第14-16页 |
| 2 绵羊支原体肺炎研究进展 | 第16-18页 |
| 2.1 病原学 | 第16-17页 |
| 2.2 流行病学 | 第17页 |
| 2.3 临床症状与病理变化 | 第17页 |
| 2.4 重要基因和蛋白 | 第17-18页 |
| 3 诊断 | 第18-22页 |
| 3.1 临床诊断与病理学诊断 | 第18页 |
| 3.2 病原分离鉴定及形态学检测 | 第18-19页 |
| 3.3 分子生物学诊断 | 第19-21页 |
| 3.4 免疫学诊断 | 第21-22页 |
| 4 防治 | 第22页 |
| 5 本研究的目的及意义 | 第22-23页 |
| 第一章 内蒙古及周边地区绵羊肺炎支原体的分离鉴定及分子流行病学研究 | 第23-35页 |
| 1 试验材料 | 第23页 |
| 1.1 标本来源及菌株 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23页 |
| 1.3 主要仪器 | 第23页 |
| 2 试验方法 | 第23-26页 |
| 2.1 培养基的制备 | 第23-24页 |
| 2.2 病料采集和病原培养 | 第24页 |
| 2.3 菌落的形态鉴定及染色 | 第24页 |
| 2.4 分子生物学鉴定 | 第24-25页 |
| 2.5 生化反应鉴定 | 第25页 |
| 2.6 生长抑制试验 | 第25页 |
| 2.7 耐药性分析 | 第25页 |
| 2.8 分子流行病学调查所用目的基因的扩增、测序 | 第25-26页 |
| 2.9 分子流行病学调查和进化分析 | 第26页 |
| 3 结果 | 第26-32页 |
| 3.1 病料采集和病原菌的鉴定 | 第26页 |
| 3.2 病原菌的分离与培养 | 第26-27页 |
| 3.3 生化鉴定结果 | 第27-28页 |
| 3.4 药敏鉴定结果 | 第28页 |
| 3.5 生长抑制结果 | 第28-29页 |
| 3.6 分子生物学鉴定结果 | 第29页 |
| 3.7 流调基因的序列分析和进化分析 | 第29-32页 |
| 4 讨论 | 第32-34页 |
| 5 小结 | 第34-35页 |
| 第二章 绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种和精氨酸支原体EVAGREEN实时荧光PCR检测方法的建立 | 第35-50页 |
| 1 试验材料 | 第35页 |
| 1.1 菌株和载体 | 第35页 |
| 1.2 主要试剂 | 第35页 |
| 1.3 主要仪器 | 第35页 |
| 2 试验方法 | 第35-38页 |
| 2.1 引物设计 | 第35-36页 |
| 2.2 菌株的扩增培养和基因组的提取 | 第36页 |
| 2.3 标准质粒的构建 | 第36-37页 |
| 2.4 标准品的制备 | 第37页 |
| 2.5 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR方法的建立 | 第37-38页 |
| 3 结果 | 第38-48页 |
| 3.1 标准质粒构建 | 第38-39页 |
| 3.2 三种标准质粒鉴定 | 第39-40页 |
| 3.3 重组标准质粒测序 | 第40-41页 |
| 3.4 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR扩增产物TM值 | 第41-42页 |
| 3.5 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR特异性 | 第42-43页 |
| 3.6 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR标准曲线制作 | 第43-44页 |
| 3.7 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR重复性 | 第44-45页 |
| 3.8 三种羊支原体EVAGREEN实时荧光PCR灵敏度 | 第45-47页 |
| 3.9 EVAGREEN实时荧光PCR方法检测临床样品 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48-49页 |
| 5 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 绵羊肺炎支原体黏附相关基因的生物信息学分析及原核表达 | 第50-65页 |
| 1 试验材料 | 第50-51页 |
| 1.1 菌株、质粒及试验动物 | 第50页 |
| 1.2 主要仪器 | 第50页 |
| 1.3 主要试剂 | 第50-51页 |
| 2 试验方法 | 第51-56页 |
| 2.1 P130A、P129、P71蛋白生物信息学分析预测 | 第51-52页 |
| 2.2 绵羊肺炎支原体的培养 | 第52页 |
| 2.3 P130A、P129、P71基因的扩增和OVERLAP PCR定点突变 | 第52-54页 |
| 2.4 截短基因重组载体的构建 | 第54页 |
| 2.5 融合蛋白的诱导表达 | 第54页 |
| 2.6 融合蛋白诱导条件的优化 | 第54-55页 |
| 2.7 重组蛋白的纯化 | 第55页 |
| 2.8 兔抗绵羊肺炎支原体多克隆抗体的制备 | 第55-56页 |
| 2.9 重组蛋白免疫印迹鉴定 | 第56页 |
| 3 结果 | 第56-63页 |
| 3.1 蛋白结构分析结果 | 第56-57页 |
| 3.2 P130、P129、P71基因的克隆及点突变结果 | 第57-58页 |
| 3.3 重组表达载体的构建及鉴定 | 第58-60页 |
| 3.4 融合蛋白诱导表达条件的优化结果 | 第60-63页 |
| 3.5 重组蛋白的免疫原性鉴定 | 第63页 |
| 4 讨论 | 第63-64页 |
| 5 小结 | 第64-65页 |
| 第四章 绵羊肺炎支原体黏附蛋白P130、P129、P71的生物学和免疫学研究 | 第65-76页 |
| 1 试验材料 | 第65页 |
| 1.1 实验动物 | 第65页 |
| 1.2 主要仪器 | 第65页 |
| 1.3 主要试剂 | 第65页 |
| 2 试验方法 | 第65-68页 |
| 2.1 重组蛋白疫苗的制备 | 第65-66页 |
| 2.2 免疫小鼠 | 第66页 |
| 2.3 免疫小鼠血清抗体水平的监测 | 第66页 |
| 2.4 生长抑制试验 | 第66-67页 |
| 2.5 免疫小鼠全血的吞噬调理试验 | 第67页 |
| 2.6 免疫小鼠TH1/TH2类细胞因子检测 | 第67页 |
| 2.7 MTT法测免疫小鼠T淋巴细胞增殖 | 第67-68页 |
| 2.8 膜蛋白在绵羊肺炎支原体的定位 | 第68页 |
| 2.9 免疫胶体金电镜检测 | 第68页 |
| 3 结果 | 第68-74页 |
| 3.1 重组蛋白免疫规律检测 | 第68-69页 |
| 3.2 重组蛋白抗血清生长抑制 | 第69页 |
| 3.3 免疫全血调理吞噬试验 | 第69-70页 |
| 3.4 TH1/TH2类细胞因子水平的检测 | 第70-71页 |
| 3.5 T淋巴细胞刺激增值试验结果 | 第71-72页 |
| 3.6 蛋白在绵羊肺炎支原体上的定位 | 第72-73页 |
| 3.7 胶体金免疫透射电镜观察 | 第73-74页 |
| 4 讨论 | 第74-75页 |
| 5 小结 | 第75-76页 |
| 第五章 绵羊气管上皮细胞的分离鉴定及绵羊肺炎支原体对其黏附的研究 | 第76-87页 |
| 1 试验材料 | 第76页 |
| 1.1 样本来源 | 第76页 |
| 1.2 主要仪器 | 第76页 |
| 1.3 主要试剂 | 第76页 |
| 2 试验方法 | 第76-80页 |
| 2.1 绵羊气管上皮细胞的分离培养 | 第76-77页 |
| 2.2 细胞的传代、冻存及复苏 | 第77页 |
| 2.3 MTT法测定细胞生长曲线 | 第77页 |
| 2.4 细胞免疫荧光法鉴定表面标志 | 第77页 |
| 2.5 染色体中期分裂相制备与组型分析 | 第77-78页 |
| 2.6 内源性微生物污染的鉴定 | 第78页 |
| 2.7 绵羊肺炎支原体浸染气管上皮细胞模型的建立 | 第78页 |
| 2.8 重组蛋白黏附细胞试验 | 第78-79页 |
| 2.9 重组蛋白抗体对全菌的黏附抑制试验 | 第79页 |
| 2.10 夹心ELISA法检测重组蛋白免疫血清对全菌体蛋白的黏附抑制试验 | 第79-80页 |
| 3 结果 | 第80-85页 |
| 3.1 绵羊气管上皮细胞的培养及形态学观察 | 第80-81页 |
| 3.2 绵羊气管上皮细胞生长曲线测定 | 第81页 |
| 3.3 细胞免疫组化的方法鉴定角蛋白8和18 | 第81-82页 |
| 3.4 细胞核型分析 | 第82页 |
| 3.5 微生物污染检测 | 第82-83页 |
| 3.6 对绵羊气管上皮细胞的黏附 | 第83页 |
| 3.7 重组蛋白抗体对全菌的黏附抑制结果 | 第83-84页 |
| 3.8 夹心ELISA法检测重组蛋白免疫血清对全菌体蛋白的黏附抑制试验 | 第84-85页 |
| 4 讨论 | 第85-86页 |
| 5 小结 | 第86-87页 |
| 第六章 基于P130-3蛋白的绵羊肺炎支原体的间接ELISA检测方法的建立 | 第87-96页 |
| 1 试验材料 | 第87-88页 |
| 1.1 血清 | 第87页 |
| 1.2 主要仪器 | 第87页 |
| 1.3 主要试剂及配制 | 第87-88页 |
| 2 试验方法 | 第88-90页 |
| 2.1 本试验中的ELISA的基本方法 | 第88页 |
| 2.2 ELISA各反应条件的优化 | 第88-90页 |
| 3 结果 | 第90-96页 |
| 3.1 抗原包被量及一抗浓度 | 第90页 |
| 3.2 一抗孵育时间的优化 | 第90-91页 |
| 3.3 封闭剂的选择 | 第91页 |
| 3.4 二抗浓度的优化 | 第91-92页 |
| 3.5 二抗孵育时间的确定 | 第92页 |
| 3.6 显色时间的确定 | 第92-93页 |
| 3.7 P130-3-ELISA阴阳性临界标准的确定 | 第93页 |
| 3.8 特异性检测结果 | 第93页 |
| 3.9 敏感性检测结果 | 第93-94页 |
| 3.10 重复性检测结果 | 第94页 |
| 3.11 临床检测应用 | 第94-95页 |
| 3.12 多种方法检测MO的比较 | 第95-96页 |
| 4 讨论 | 第96页 |
| 5 小结 | 第96页 |
| 全文讨论 | 第96-98页 |
| 全文结论 | 第98-99页 |
| 致谢 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-109页 |
| 作者简介 | 第109页 |
