| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 研究背景综述 | 第12-39页 |
| 第一节 小分子非编码RNA的研究进展 | 第13-31页 |
| 一、piRNA的研究进展 | 第13-22页 |
| 1. piRNA的发现 | 第13-14页 |
| 2. piRNA的分类 | 第14页 |
| 3. piRNA的结构特点 | 第14-16页 |
| 4. piRNA的生物合成 | 第16-20页 |
| 5. piRNA的生物功能 | 第20-21页 |
| 5.1 保护基因组的稳定性 | 第20-21页 |
| 5.2 piRNA调控mRNA的表达 | 第21页 |
| 6. piRNA与男性不孕不育 | 第21-22页 |
| 二、microRNA的研究进展 | 第22-28页 |
| 1. microRNA的发现 | 第22页 |
| 2. microRNA结构特点 | 第22页 |
| 3. microRNA生物合成 | 第22-24页 |
| 4. microRNA作用机制 | 第24-26页 |
| 4.1 miRNA介导mRNA特异性切割 | 第25页 |
| 4.2 miRNA抑制mRNA转录后翻译 | 第25-26页 |
| 5. microRNA与癌症 | 第26-27页 |
| 6. microRNA与乳腺癌 | 第27-28页 |
| 三、研究小分子非编码RNA的意义及前景展望 | 第28-31页 |
| 1. 小分子非编码RNA的生物学意义 | 第28-29页 |
| 2. 小分子非编码RNA的前景与展望 | 第29-31页 |
| 参考文献 | 第31-39页 |
| 第二章 实验研究部分 | 第39-147页 |
| 第一节 男子生精功能发生过程中piRNA功能的初步研究 | 第40-99页 |
| 第一部分 piRNA在男性不育精浆中的差异表达 | 第40-79页 |
| 一、引言 | 第40-42页 |
| 二、实验材料和方法 | 第42-54页 |
| 1. 研究对象和样品收集 | 第42-44页 |
| 1.1 样本收集 | 第42页 |
| 1.2 样本处理 | 第42-44页 |
| 2. 主要仪器设备和试剂 | 第44-45页 |
| 2.1 实验仪器设备 | 第44页 |
| 2.2 实验所用试剂 | 第44-45页 |
| 3. 实验方法 | 第45-47页 |
| 3.1 RNA提取 | 第45-46页 |
| 3.2 反应体系的配制 | 第46-47页 |
| 4. Solexa测序 | 第47-49页 |
| 5. qRT-PCR检测piRNA的表达 | 第49-51页 |
| 5.1 piRNA表达量的检测 | 第49-50页 |
| 5.2 精浆中piRNA的稳定性检测 | 第50页 |
| 5.3 精浆中piRNA可检测性 | 第50-51页 |
| 5.4 piRNA引物探针扩增的特异性 | 第51页 |
| 6. Northern blotting方法检测精浆中piRNA | 第51-53页 |
| 7. 数据分析 | 第53-54页 |
| 三、实验结果 | 第54-74页 |
| 1. 三组混合精浆测序结果 | 第54-62页 |
| 1.1 三组混合精浆中小分子RNA | 第54-58页 |
| 1.2 精浆中小RNA的长度分布 | 第58-59页 |
| 1.3 三组精浆中piRNA的分布 | 第59-60页 |
| 1.4 不育患者精浆piRNA表达谱与正常对照的差异 | 第60-62页 |
| 2. 验证qRT-PCR方法的可靠性与可行性 | 第62-64页 |
| 2.1 扩增检测piRNA的探针及引物的水背景 | 第62-63页 |
| 2.2 精浆中piRNA可检测性 | 第63页 |
| 2.3 qRT-PCR扩增的特异性 | 第63-64页 |
| 2.4 精浆中piRNA的稳定性 | 第64页 |
| 3. Northern blotting法检测精浆中piRNA | 第64-65页 |
| 4. qRT-PCR法检测精浆中piRNA含量 | 第65-71页 |
| 4.1 piRNA标准曲线 | 第65-66页 |
| 4.2 qRT-PCR对Solexa初筛的piRNA进行复筛 | 第66-67页 |
| 4.3 qRT-PCR对复筛的结果的验证 | 第67-69页 |
| 4.4 5种piRNA在不育患者与正常对照精浆中的表达量 | 第69-71页 |
| 5. 不育男性患者特异降低的精浆piRNA的ROC曲线分析 | 第71-72页 |
| 6. Risk score分析 | 第72-74页 |
| 四、结论 | 第74-75页 |
| 五、讨论 | 第75-77页 |
| 参考文献 | 第77-79页 |
| 第二部分 piRNA在男性不育精子中的差异表达及机制的初步研究 | 第79-99页 |
| 一、引言 | 第79-81页 |
| 二、实验材料和方法 | 第81-88页 |
| 1. 样本收集及处理 | 第81-82页 |
| 1.1 样本收集 | 第81页 |
| 1.2 样本处理 | 第81-82页 |
| 2. 主要仪器设备和试剂 | 第82-83页 |
| 2.1 实验仪器设备 | 第82页 |
| 2.2 实验所用试剂 | 第82-83页 |
| 3. 实验方法 | 第83-87页 |
| 3.1 精子的分离及RNA的提取 | 第83页 |
| 3.2 精子中蛋白的提取 | 第83-84页 |
| 3.3 Western blot检测精子中的蛋白表达 | 第84-86页 |
| 3.4 精浆中外泌体的提取 | 第86页 |
| 3.5 精浆外泌体鉴定 | 第86-87页 |
| 3.6 外泌体中RNA的提取、逆转和qRT-PCR | 第87页 |
| 4. 数据分析 | 第87-88页 |
| 三、实验结果 | 第88-94页 |
| 1. 精子中Solexa结果 | 第88-90页 |
| 1.1 精子中piRNA种类及含量 | 第88页 |
| 1.2 精子中piRNA表达谱 | 第88-89页 |
| 1.3 精浆中表达差异显著的piRNA在精子中的变化 | 第89-90页 |
| 1.4 qRT-PCR对Solexa初筛的4个piRNA进行验证 | 第90页 |
| 2. MitoPLD蛋白在弱精症精子中表达量下降 | 第90-91页 |
| 3. 精浆中外泌体的分布 | 第91-92页 |
| 4. 精浆中piRNA的存在形式 | 第92-93页 |
| 5. 精浆Exosome中piRNA的差异表达 | 第93-94页 |
| 四、结论 | 第94-95页 |
| 五、讨论 | 第95-97页 |
| 参考文献 | 第97-99页 |
| 第二节 miR-96在乳腺癌中通过靶向PTPN9蛋白促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭 | 第99-147页 |
| 一、引言 | 第99-103页 |
| 二、实验材料与方法 | 第103-125页 |
| 1. 实验样本与材料 | 第103-106页 |
| 2. 实验方法 | 第106-125页 |
| 2.1 细胞培养 | 第106页 |
| 2.2 miRNA的过表达和干扰 | 第106页 |
| 2.3 构建含PTPN9 3'-UTR的荧光素酶报告质粒 | 第106-111页 |
| 2.4 除内毒素质粒的抽提(用于转染细胞) | 第111-112页 |
| 2.5 荧光素酶实验 | 第112-113页 |
| 2.6 miRNA及mRNA的qRT-PCR定量检测 | 第113-117页 |
| 2.7 PTPN9蛋白的过表达和下调表达 | 第117页 |
| 2.8 Western blot检测蛋白表达水平 | 第117-120页 |
| 2.9 EdU实验-荧光显微镜检测方法 | 第120-122页 |
| 2.10 细胞周期实验 | 第122-123页 |
| 2.11 细胞迁移实验 | 第123页 |
| 2.12 细胞侵袭实验 | 第123-124页 |
| 2.13 数值的统计分析 | 第124-125页 |
| 三、实验结果 | 第125-141页 |
| 1. miR-96在人乳腺癌样本中表达成上升趋势 | 第125页 |
| 2. 动物实验显示miR-96促进肿瘤生成 | 第125-127页 |
| 3. 体外细胞实验显示miR-96促进细胞增殖与侵袭 | 第127-132页 |
| 3.1 miR-96促进细胞的增殖 | 第127-129页 |
| 3.2 miR-96促进细胞迁移 | 第129页 |
| 3.3 miR-96促进细胞的侵袭 | 第129-130页 |
| 3.4 miR-96促进细胞周期进程 | 第130-132页 |
| 4. PTPN9是miR-96潜在的靶点 | 第132-134页 |
| 5. PTPN9蛋白在乳腺癌中表达量下降 | 第134-135页 |
| 6. 细胞实验验证miR-96靶向PTPN9 | 第135-137页 |
| 7. PTPN9蛋白在乳腺癌细胞系中的生物学功能 | 第137-140页 |
| 8. 验证miR-96和PTPN9对乳腺癌细胞的生物学功能成负调控模式 | 第140-141页 |
| 四、结论 | 第141页 |
| 五、讨论 | 第141-144页 |
| 参考文献 | 第144-147页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148-150页 |
