| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-24页 |
| ·海参概述 | 第11-12页 |
| ·海参的自溶 | 第12页 |
| ·蛋白酶和组织蛋白酶 | 第12-15页 |
| ·蛋白酶 | 第12页 |
| ·组织蛋白酶 | 第12-15页 |
| ·组织蛋白酶的简介 | 第12-13页 |
| ·组织蛋白酶的结构 | 第13-14页 |
| ·组织蛋白酶 L 的鉴定 | 第14页 |
| ·组织蛋白酶 L 研究进展及意义 | 第14-15页 |
| ·PCR 扩增 | 第15-16页 |
| ·DNA 酶切 | 第16页 |
| ·凝胶电泳 | 第16-18页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第16-17页 |
| ·SDS-PAGE | 第17-18页 |
| ·外源基因的原核表达 | 第18-23页 |
| ·原核表达系统 | 第18页 |
| ·原核表达载体 | 第18-20页 |
| ·原核表达菌株 | 第20页 |
| ·原核表达中包涵体的形成 | 第20-21页 |
| ·减少包涵体形成的方法 | 第21页 |
| ·包涵体的复性 | 第21-23页 |
| ·本课题的主要研究思路和内容 | 第23-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-45页 |
| ·实验材料 | 第24-29页 |
| ·实验原料 | 第24页 |
| ·主要实验仪器 | 第24-25页 |
| ·主要实验试剂 | 第25-26页 |
| ·主要溶液的配置 | 第26-29页 |
| ·培养基 | 第26-27页 |
| ·电泳用溶液 | 第27-28页 |
| ·亲和层析柱用液 | 第28页 |
| ·酶活性检测反应溶液 | 第28页 |
| ·其他溶液 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-45页 |
| ·海刺参肠 RNA 的提取 | 第29-31页 |
| ·材料的准备 | 第29页 |
| ·海刺参肠 RNA 的提取 | 第29-31页 |
| ·组织蛋白酶 L 序列分析 | 第31页 |
| ·基因克隆的 PCR 引物设计与合成 | 第31页 |
| ·SjCL 基因的 RT-PCR 扩增和产物的回收纯化 | 第31-33页 |
| ·SjCL 基因的 RT-PCR 扩增 | 第31-32页 |
| ·RT-PCR 扩增产物的检测 | 第32页 |
| ·RT-PCR 扩增产物的回收纯化 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的构建、转化及阳性克隆的筛选 | 第33-35页 |
| ·重组质粒 pMD18-T-SjCL 的构建 | 第33页 |
| ·重组质粒 pMD18-T-SjCL 的转化及重组质粒的阳性克隆筛选 | 第33-35页 |
| ·重组质粒 pMD18-T-SjCL 的提取 | 第35-36页 |
| ·重组质粒 pMD18-T-SjCL 的酶切 | 第36页 |
| ·组织蛋白酶 L 基因在大肠杆菌中的表达 | 第36-38页 |
| ·pET32a(+)-SjCL 重组质粒的构建 | 第36页 |
| ·扩大培养 | 第36-37页 |
| ·菌种的诱导及表达 | 第37页 |
| ·菌体的破碎 | 第37-38页 |
| ·SDS-PAGE | 第38-39页 |
| ·胶板的制备 | 第38页 |
| ·样品的处理 | 第38-39页 |
| ·加样方法 | 第39页 |
| ·电泳 | 第39页 |
| ·染色 | 第39页 |
| ·脱色 | 第39页 |
| ·蛋白大小的确定 | 第39页 |
| ·包涵体的处理 | 第39-41页 |
| ·包涵体的收集 | 第40页 |
| ·包涵体的洗涤，变性 | 第40-41页 |
| ·纯化 | 第41-43页 |
| ·纯化及复性 | 第41-42页 |
| ·Lowry 法测定蛋白质含量 | 第42-43页 |
| ·SjCL 活性鉴定 | 第43-45页 |
| ·紫外光谱法确定底物标准品 NMec 的最大吸光度值 | 第43页 |
| ·荧光光谱法确定 NMec 最大荧光强度值 | 第43页 |
| ·NMec 标准曲线的绘制 | 第43页 |
| ·酶活力的测定 | 第43-44页 |
| ·SjCL 底物特异性的研究 | 第44-45页 |
| 第三章 实验结果和讨论 | 第45-61页 |
| ·海参肠总 RNA 的质量分析 | 第45页 |
| ·海刺参组织蛋白酶 L 序列分析 | 第45-48页 |
| ·海刺参组织蛋白酶 L 序列分析 | 第45-47页 |
| ·海刺参组织蛋白酶 L 序列系统进化树分析 | 第47-48页 |
| ·RT-PCR 反应扩增 SjCL 基因 | 第48-49页 |
| ·pMD18-T-SjCL 重组子构建及酶切鉴定 | 第49-51页 |
| ·pMD18-T-SjCL 重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| ·pMD18-T-SjCL 重组质粒的酶切鉴定 | 第50-51页 |
| ·pET32a(+)-SjCL 重组子及酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·pET32a(+)-SjCL 重组质粒的构建 | 第51页 |
| ·pET32a(+)-SjCL 重组质粒酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组 SjCL 基因工程菌在大肠杆菌中表达条件的确定 | 第52-53页 |
| ·包涵体超声破碎条件的确定 | 第53-55页 |
| ·菌体破碎方法的确定 | 第53-54页 |
| ·超声波破碎方法的优化 | 第54页 |
| ·表达产物形式的确定 | 第54-55页 |
| ·重组 SjCL 蛋白的含量测定 | 第55-57页 |
| ·亲和层析纯化 | 第55-56页 |
| ·目的蛋白的含量测定 | 第56-57页 |
| ·重组 SjCL 酶活性鉴定 | 第57-61页 |
| ·紫外光谱法确定底物标准品 NMec 的最大吸光度值 | 第57-58页 |
| ·荧光光谱法确定 NMec 最大荧光强度值 | 第58-59页 |
| ·NMec 标准曲线 | 第59页 |
| ·酶活力的测定及底物特异性鉴定 | 第59-61页 |
| 第四章 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
