| 摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 中英文对照表 | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-33页 |
| 1 2A肽在生物医药和生物技术中的研究进展 | 第16-27页 |
| ·2A肽的起源 | 第16-17页 |
| ·常见的2A肽及类2A肽序列 | 第17-18页 |
| ·2A肽的作用机制 | 第18-20页 |
| ·2A肽介导的蛋白的亚细胞定位 | 第20页 |
| ·2A肽的作用效率 | 第20-22页 |
| ·2A肽的应用 | 第22-24页 |
| ·多基因共表达构建策略 | 第24-26页 |
| ·慢病毒多基因共表达载体 | 第26-27页 |
| ·前景 | 第27页 |
| 2 DNA甲基化在动物中的研究进展 | 第27-33页 |
| ·DNA甲基化的表型特征 | 第27-28页 |
| ·DNA甲基化作用机制 | 第28-29页 |
| ·DNA甲基化调控信号 | 第29页 |
| ·DNA甲基化的分析方法 | 第29页 |
| ·DNA甲基化调节因子 | 第29-30页 |
| ·DNA甲基化抑制剂 | 第30页 |
| ·DNA甲基化与染色质相关性 | 第30-31页 |
| ·组蛋白修饰 | 第31页 |
| ·组蛋白去乙酰化酶抑制剂 | 第31页 |
| ·甲基化在家畜中的研究现状 | 第31-33页 |
| 第二章 三荧光基因共表达载体pLEX-2A-TYG的构建及其在真核细胞中的表达 | 第33-53页 |
| 1 实验材料 | 第34-38页 |
| ·本实验使用的载体 | 第34页 |
| ·本实验使用的细胞株 | 第34页 |
| ·本实验主要试剂 | 第34页 |
| ·本实验主要仪器 | 第34-35页 |
| ·主要试剂的配制 | 第35-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-45页 |
| ·2A-linker的构建 | 第38页 |
| ·引物的设计 | 第38页 |
| ·多聚酶链式反应（PCR） | 第38-39页 |
| ·限制性酶酶切实验 | 第39-40页 |
| ·连接反应 | 第40页 |
| ·克隆转化 | 第40-41页 |
| ·阳性重组子的筛选鉴定9 | 第41页 |
| ·胶回收实验9 | 第41-42页 |
| ·细胞的培养10 | 第42-43页 |
| ·质粒的提取 | 第43页 |
| ·质粒转染实验 | 第43-44页 |
| ·荧光显微镜检测12 | 第44页 |
| ·Western blotting检测 | 第44-45页 |
| 3 结果 | 第45-50页 |
| ·2A肽-linker片段的获取 | 第45-46页 |
| ·质粒pacGFP1-N1的改造 | 第46页 |
| ·质粒ptdtomato-2A和pzsYellow1-2A的获得 | 第46页 |
| ·质粒ptdTomato-acGFP1和质粒pzsYellow1-acGFP1的获得 | 第46页 |
| ·质粒p2A-TYG的获得 | 第46-47页 |
| ·质粒pLEX-2A-TYG的获得 | 第47-48页 |
| ·质粒转染的荧光检测 | 第48-49页 |
| ·Western blotting检测结果 | 第49-50页 |
| 4 讨论 | 第50-53页 |
| ·Kozak consensus sequence | 第50-51页 |
| ·2A肽介导的多基因载体在细胞中表达 | 第51页 |
| ·酶切位点的保护碱基 | 第51-52页 |
| ·多基因载体中三荧光蛋白基因的表达检测结果分析 | 第52-53页 |
| 第三章 慢病毒的包装及滴毒检测 | 第53-65页 |
| 1 实验材料和方法 | 第54-55页 |
| ·实验细胞株 | 第54页 |
| ·实验所用载体 | 第54页 |
| ·实验主要试剂 | 第54页 |
| ·主要试剂的配制 | 第54-55页 |
| ·主要实验仪器 | 第55页 |
| 2 实验方法 | 第55-60页 |
| ·细胞的培养 | 第55页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第55-56页 |
| ·病毒的包装 | 第56-57页 |
| ·慢病毒滴度的测定 | 第57-59页 |
| ·慢病毒的感染 | 第59页 |
| ·单克隆细胞的筛选 | 第59页 |
| ·激光共聚焦检测 | 第59-60页 |
| 3 结果 | 第60-61页 |
| ·质粒的质量和浓度检测 | 第60页 |
| ·包装病毒的滴度检测 | 第60页 |
| ·单克隆细胞的筛选及检测 | 第60-61页 |
| 4 讨论 | 第61-65页 |
| ·慢病毒载体特点 | 第61-62页 |
| ·慢病毒的包装 | 第62页 |
| ·病毒的浓缩 | 第62页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第62-64页 |
| ·提高病毒载体体外感染的能力 | 第64页 |
| ·实验室安全措施 | 第64-65页 |
| 第四章 转基因羊的生产和检测 | 第65-88页 |
| 1 实验材料 | 第66-67页 |
| ·实验动物 | 第66页 |
| ·实验试剂 | 第66页 |
| ·主要试剂的配制 | 第66-67页 |
| ·主要仪器 | 第67页 |
| 2 实验方法 | 第67-79页 |
| ·转基因羊的生产 | 第67-68页 |
| ·转基因羊尾组织 DNA 的提取 | 第68-69页 |
| ·转基因羊的 PCR 检测 | 第69-70页 |
| ·Western blotting 检测 | 第70页 |
| ·基因组 DNA Southern blotting | 第70-72页 |
| ·RT-PCR 检测 | 第72-75页 |
| ·DNA 甲基化分析 | 第75-79页 |
| ·CMV 启动子转录因子结合位点分析 | 第79页 |
| ·统计分析 | 第79页 |
| 3 结果 | 第79-83页 |
| ·三色荧光蛋白基因共表达慢病毒转基因羊的生产情况 | 第79-80页 |
| ·转基因羊的整合检测结果 | 第80页 |
| ·转基因羊甲基化分析 | 第80-82页 |
| ·CMV启动子转录因子结合位点分析结果 50 | 第82-83页 |
| 4 讨论 | 第83-88页 |
| ·慢病毒载体在转基因动物中的应用 | 第83-85页 |
| ·2A肽在慢病毒介导的生物技术中的应用 | 第85-86页 |
| ·转基因羊DNA甲基化分析 | 第86页 |
| ·DNA甲基化检测方法 | 第86-87页 |
| ·CMV启动子转录因子结合位点 | 第87-88页 |
| 第五章 转基因羊内外源基因 DN A 甲基化机制初步研究 | 第88-105页 |
| 1 材料和方法 | 第89-90页 |
| ·实验试剂 | 第89页 |
| ·实验材料 | 第89页 |
| ·实验仪器 | 第89页 |
| ·主要试剂的配制 | 第89-90页 |
| 2 实验方法 | 第90-93页 |
| ·成纤维细胞的分离 | 第90页 |
| ·成纤维细胞的纯化 | 第90-91页 |
| ·纤维细胞的培养 | 第91-92页 |
| ·转基因成纤维细胞的药物处理实验 | 第92页 |
| ·荧光显微镜检测 | 第92-93页 |
| ·流式细胞术检测 | 第93页 |
| ·统计分析 | 第93页 |
| 3 结果 | 第93-101页 |
| ·成纤维细胞的分离和纯化 | 第93-94页 |
| ·TSA和5-azaC对成纤维细胞表观状态的影响 | 第94页 |
| ·流式细胞术检测结果 | 第94-101页 |
| 4 讨论 | 第101-105页 |
| ·转基因表达的影响因素 | 第101-102页 |
| ·DN A 甲基化转移酶抑制剂-5-azaC | 第102-103页 |
| ·去乙酰化酶抑制剂 - TSA | 第103页 |
| ·流式细胞术检测 | 第103-105页 |
| 第六章 小结、创新点、展望 | 第105-107页 |
| 1 小结 | 第105-106页 |
| 2 创新点 | 第106页 |
| 3 展望 | 第106-107页 |
| 参考文献 | 第107-115页 |
| 附录 | 第115-123页 |
| 作者简介 | 第123-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 导师评阅表 | 第125页 |
