| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-24页 |
| 第一章 绪论 | 第24-36页 |
| ·调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs) | 第24-27页 |
| ·调节性T细胞的分类 | 第24-25页 |
| ·CD4~+CD25~+调节性T细胞特点及功能 | 第25页 |
| ·CD4~+CD25~+调节性T细胞与临床疾病 | 第25-26页 |
| ·CD4~+CD25~+调节性T细胞体外诱导扩增 | 第26-27页 |
| ·Foxp3 | 第27-33页 |
| ·Fox家族与Foxp3 | 第27-29页 |
| ·Foxp3与Tregs | 第29-30页 |
| ·Foxp3、RORγt和Tregs与Th17的平衡 | 第30-31页 |
| ·Foxp3和Th1 | 第31-33页 |
| ·PTD简介 | 第33-36页 |
| ·蛋白转导域的来源与TAT-PTD结构特点 | 第33-34页 |
| ·PTD作用特点及机制 | 第34页 |
| ·PTD的应用 | 第34-36页 |
| 第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义 | 第36-39页 |
| ·研究目的 | 第36页 |
| ·研究方法及实验设计方案 | 第36-37页 |
| ·本研究的意义 | 第37-39页 |
| 第三章 PTD-hFOXP3诱导CD4~+CD25~-T细胞为Treg样细胞 | 第39-75页 |
| ·实验材料 | 第39-43页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第39-40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·主要仪器 | 第40-41页 |
| ·主要溶液 | 第41-43页 |
| ·方法 | 第43-60页 |
| ·pET28a-PTD-hFOXP3,pET28a-hFOXP3和pET28a-PTD-eGFP融合蛋白的制备 | 第43-48页 |
| ·Rosetta感受态的制备 | 第43-44页 |
| ·重组质粒转化 | 第44页 |
| ·融合蛋白的诱导表达 | 第44-45页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| ·融合蛋白的脱盐 | 第46页 |
| ·融合蛋白去内毒素 | 第46-47页 |
| ·融合蛋白的SDS-PAGE电泳 | 第47-48页 |
| ·PTD-hFOXP3的细胞增殖抑制实验 | 第48-50页 |
| ·外周血单个核细胞(PBMC)的分离 | 第48页 |
| ·磁珠法分离人CD4~+T,CD4~+CD25~-T,CD4~+CD25~+T细胞 | 第48-50页 |
| ·刺激剂浓度的确定 | 第50页 |
| ·细胞增殖抑制试验 | 第50页 |
| ·CD4~+CD25~-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4 mRNA表达水平的检测 | 第50-56页 |
| ·标准质粒的构建 | 第50-55页 |
| ·定量PCR标准曲线的绘制 | 第55页 |
| ·CD4~+CD25~-T细胞活化不同时间的细胞因子分泌谱 | 第55页 |
| ·PTD-hFOXP3对CD4~+CD25~-T细胞的细胞因子及CTLA-4mRNA表达水平的作用 | 第55-56页 |
| ·PBMCs分泌的细胞因子及CD4~+CD25~T细胞的CTLA-4蛋白水平的检测 | 第56-57页 |
| ·标本的收集 | 第56页 |
| ·ELISA检测标本 | 第56-57页 |
| ·Flow cytomctry检测CTLA-4蛋白水平的检测 | 第57页 |
| ·PTD-hFOXP3转导的CD4~+CD25~-T细胞的免疫抑制实验 | 第57页 |
| ·双向混合淋巴细胞反应(MLR) | 第57-58页 |
| ·染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第58-60页 |
| ·统计学处理 | 第60页 |
| ·实验结果 | 第60-73页 |
| ·成功制备PTD-hFOXP3、hFOXP3和PTD-eGFP融合蛋白 | 第60-61页 |
| ·确定T细胞活化条件 | 第61-62页 |
| ·PTD-hFOXP3抑制活化CD4~+CD25~-T细胞的增殖 | 第62-63页 |
| ·PTD-hFOXP3对CD4~+CD25~-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4表达的影响 | 第63-70页 |
| ·标准质粒的构建 | 第64页 |
| ·CD4~+CD25~-T细胞活化不同时间细胞因子及CTLA-4表达情况 | 第64-66页 |
| ·融合蛋白对CD4~+CD25~-T细胞分泌的细胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影响 | 第66-67页 |
| ·ELISA检测融合蛋白对PBMC分泌的细胞因子在蛋白水平上的影响 | 第67-68页 |
| ·Flow cytometry检测CTLA-4蛋白水平的检测 | 第68-70页 |
| ·PTD-hFOXP3转导的CD4~+CD25~-T细胞对效应细胞的增殖抑制作用 | 第70-71页 |
| ·PTD-hFOXP3抑制双向混合淋巴细胞反应(MLR) | 第71页 |
| ·PTD-hFOXP3能够直接结合CD4~+CD25~-T细胞的IL-2启动子而下调其表达 | 第71-73页 |
| ·讨论 | 第73-74页 |
| ·小结 | 第74-75页 |
| 第四章 PTD-mFoxp3对Th17、Th1体外分化的影响 | 第75-93页 |
| ·材料 | 第75-76页 |
| ·实验菌株和质粒 | 第75页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第75-76页 |
| ·方法 | 第76-81页 |
| ·PTD-mFoxp3与mFoxp3融合蛋白的制备 | 第76页 |
| ·磁珠法分离小鼠CD4~+T细胞 | 第76-77页 |
| ·准备工作 | 第76页 |
| ·洗磁珠 | 第76-77页 |
| ·阴性分选小鼠CD4~+T细胞 | 第77页 |
| ·体外诱导鼠Th17的分化 | 第77-78页 |
| ·定量PCR检测mouse IL-17A和mouse RORγt在mRNA水平的表达 | 第78-79页 |
| ·流式细胞术检测胞内mouse IL-17A的表达 | 第79页 |
| ·ELISA方法检测mouse IL-17A的表达 | 第79-80页 |
| ·PTD-mFoxp3对鼠Th1体外分化的影响 | 第80-81页 |
| ·统计学处理 | 第81页 |
| ·实验结果 | 第81-91页 |
| ·成功制备PTD-mFoxp3与mFoxp3融合蛋白 | 第81-82页 |
| ·鼠IL-17A和RORγt标准质粒的构建 | 第82-83页 |
| ·鼠Th17体外分化条件的摸索 | 第83-84页 |
| ·定量PCR检测PTD-mFoxp3对IL-17A和RORγt mRNA表达水平的影响 | 第84-85页 |
| ·流式细胞术检测PTD-mFoxp3对IL-17A蛋白表达变化的影响 | 第85-87页 |
| ·ELISA检测PTD-mFoxp3对IL-17A蛋白表达变化的影响 | 第87-88页 |
| ·鼠IFN-γ和T-bet标准质粒的构建 | 第88页 |
| ·PTD-mFoxp3对IFN-γ和T-bet mRNA表达水平的影响 | 第88-89页 |
| ·PTD-mFoxp3对IFN-γ和T-bet蛋白水平的影响 | 第89-91页 |
| ·讨论 | 第91-92页 |
| ·小结 | 第92-93页 |
| 第五章 PTD-mFoxp3对小鼠迟发型超敏反应的治疗作用及其初步机制研究 | 第93-111页 |
| ·材料 | 第93-94页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第93页 |
| ·实验动物 | 第93-94页 |
| ·方法 | 第94-98页 |
| ·DTH模型的建立 | 第94页 |
| ·PTD-mFoxp3的治疗 | 第94页 |
| ·观测指标 | 第94-98页 |
| ·小鼠一般情况 | 第94-95页 |
| ·小鼠耳廓肿胀程度 | 第95页 |
| ·小鼠耳片重量差 | 第95页 |
| ·胸腺指数和脾脏指数 | 第95页 |
| ·小鼠耳廓局部组织变化 | 第95页 |
| ·小鼠脾脏细胞的增殖活性 | 第95-96页 |
| ·耳引流淋巴结中Tregs和Th1细胞的分布 | 第96页 |
| ·耳片组织中IFN-γ与T-bet的表达 | 第96-97页 |
| ·淋巴结细胞与脾细胞培养上清IFN-γ的检测 | 第97-98页 |
| ·统计学处理 | 第98页 |
| ·实验结果 | 第98-110页 |
| ·成功复制了DTH模型 | 第98-99页 |
| ·PTD-mFoxp3对DTH小鼠的治疗作用 | 第99-110页 |
| ·讨论 | 第110页 |
| ·小结 | 第110-111页 |
| 第六章 主要结论及展望 | 第111-112页 |
| ·主要结论 | 第111页 |
| ·展望 | 第111-112页 |
| 参考文献 | 第112-121页 |
| 致谢 | 第121-123页 |
| 攻读博士学位发表的学术论文及其他科研成果 | 第123-124页 |
