| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-35页 |
| 1 前言 | 第15-16页 |
| 2 文献综述 | 第16-33页 |
| ·角蛋白 | 第16页 |
| ·角蛋白的降解 | 第16-18页 |
| ·角蛋白酶 | 第18-22页 |
| ·嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA | 第22-29页 |
| ·角蛋白生物降解酶的应用 | 第29-33页 |
| 3 本研究的目的、内容和意义与技术路线 | 第33-35页 |
| ·研究目的 | 第33页 |
| ·研究内容 | 第33页 |
| ·研究意义 | 第33-34页 |
| ·技术路线 | 第34-35页 |
| 第二章 TfpA酶降解羽毛能力及机理的探讨 | 第35-56页 |
| 摘要 | 第35页 |
| 1 前言 | 第35-36页 |
| 2 实验材料 | 第36-40页 |
| ·菌株 | 第36页 |
| ·主要生化试剂 | 第36页 |
| ·培养基的配制 | 第36-38页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液配制 | 第38页 |
| ·蛋白纯化缓冲液配制 | 第38页 |
| ·Western blot相关溶液配制 | 第38-39页 |
| ·BCA工作液 | 第39页 |
| ·蛋白酶活性测定相关溶液配制 | 第39页 |
| ·还原酶活性测定相关溶液配制 | 第39页 |
| ·游离氨基酸测定相关溶液配制 | 第39页 |
| ·羽毛消化相关溶液配制 | 第39-40页 |
| ·主要仪器设备 | 第40页 |
| 3 实验方法 | 第40-46页 |
| ·重组TfpA基因在毕赤酵母X33中的诱导表达 | 第40-41页 |
| ·蛋白酶活性测定方法 | 第41页 |
| ·重组TfpA蛋白的浓缩 | 第41页 |
| ·重组TfpA蛋白的分离纯化 | 第41页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE电泳胶的配制及电泳 | 第42-43页 |
| ·目的蛋白的Western blot分析 | 第43-44页 |
| ·还原酶活性测定 | 第44页 |
| ·游离氨基酸测定-福林酚法 | 第44页 |
| ·在PMSF作用下测定重组TfpA蛋白酶活 | 第44页 |
| ·在PMSF作用下重组TfpA降解羽毛 | 第44-45页 |
| ·在不同浓度Na_2SO_3作用下重组TfpA降解羽毛粉 | 第45页 |
| ·在Na_2SO_3作用下重组TfpA降解羽毛粉 | 第45-46页 |
| ·数据统计分析 | 第46页 |
| 4 实验结果与分析 | 第46-54页 |
| ·重组TfpA在毕赤酵母中的表达与浓缩 | 第46页 |
| ·重组TfpA的纯化和Western blot分析 | 第46-48页 |
| ·重组TfpA酶对羽毛的降解分析 | 第48页 |
| ·重组TfpA还原酶活性测定 | 第48-49页 |
| ·PMSF对重组TfpA酶活力的抑制 | 第49-50页 |
| ·PMSF对r-TfpA消化羽毛的抑制 | 第50-51页 |
| ·不同浓度Na_2SO_3对r-TfpA降解羽毛粉的影响 | 第51-52页 |
| ·不同反应时间对Na_2SO_3作用下重组TfpA降解羽毛粉的影响 | 第52-54页 |
| 5 讨论 | 第54-56页 |
| 第三章 定点突变tfpA基因在毕赤酵母中的表达 | 第56-82页 |
| 摘要 | 第56页 |
| 1 前言 | 第56-57页 |
| 2 实验材料 | 第57-59页 |
| ·菌株及载体 | 第57页 |
| ·引物合成 | 第57页 |
| ·定点突变使用酶及试剂盒 | 第57页 |
| ·限制酶、连接酶 | 第57页 |
| ·质粒抽提、胶回收试剂盒 | 第57页 |
| ·主要生化试剂 | 第57页 |
| ·培养基的配制 | 第57-58页 |
| ·SDS-PAGE相关溶液配制 | 第58-59页 |
| ·蛋白纯化缓冲液配制 | 第59页 |
| ·Western blot相关溶液配制 | 第59页 |
| ·BCA工作液 | 第59页 |
| ·蛋白酶活性测定相关溶液配制 | 第59页 |
| ·主要仪器设备 | 第59页 |
| 3 实验方法 | 第59-73页 |
| ·TfpA的生物信息学分析 | 第59-60页 |
| ·定点突变位点设计 | 第60-61页 |
| ·模板pPICTFP质粒的提取 | 第61页 |
| ·扩增环状质粒全长的突变方法 | 第61-63页 |
| ·核酸电泳 | 第63页 |
| ·DNA回收 | 第63-64页 |
| ·Dpn I酶切 | 第64页 |
| ·完整TfpA基因的突变cDNA扩增 | 第64-68页 |
| ·第二轮PCR产物和pPICZaA质粒的酶切和连接 | 第68-69页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态制作与转化 | 第69-70页 |
| ·菌落PCR检测 | 第70页 |
| ·质粒双酶切鉴定 | 第70-71页 |
| ·序列测定和分析 | 第71页 |
| ·重组突变TfpA基因的酵母转化与表达 | 第71页 |
| ·毕赤酵母的转化与X33-pPICTFP突变转化子的筛选 | 第71-73页 |
| 4 实验结果与分析 | 第73-80页 |
| ·TfpA突变体的载体构建 | 第73-74页 |
| ·两步法得到目的定点突变体 | 第74-75页 |
| ·TfpA突变体的序列测定 | 第75-76页 |
| ·重组突变质粒pPICTFP的电转化及转化子的筛选 | 第76页 |
| ·重组突变TfpA酵母诱导培养及酶活分析 | 第76-77页 |
| ·重组TfpA的大量表达及浓缩 | 第77-78页 |
| ·重组子表达TfpA突变蛋白的分离纯化和Western blot分析 | 第78-80页 |
| ·纯化重组野生和突变TfpA蛋白酶比活力 | 第80页 |
| 5 讨论 | 第80-82页 |
| 第四章 tfpA基因在酿酒酵母中的表达 | 第82-92页 |
| 摘要 | 第82页 |
| 1 前言 | 第82-83页 |
| 2 实验材料 | 第83-84页 |
| ·菌株 | 第83页 |
| ·主要试剂盒和生化试剂 | 第83页 |
| ·培养基的配制 | 第83页 |
| ·SDS-PAGE试剂配制 | 第83-84页 |
| ·蛋白纯化缓冲液配制 | 第84页 |
| ·Western blot相关溶液配制 | 第84页 |
| ·BCA工作液 | 第84页 |
| ·主要仪器设备 | 第84页 |
| 3 实验方法 | 第84-86页 |
| ·TfpA在酿酒酵母和毕赤酵母中的小量诱导表达 | 第84-85页 |
| ·酶活性测定方法 | 第85页 |
| ·TfpA在酿酒酵母中的大量诱导表达 | 第85页 |
| ·重组TfpA蛋白的浓缩 | 第85-86页 |
| ·重组TfpA蛋白的分离纯化 | 第86页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第86页 |
| ·重组TfpA酶比活的测定 | 第86页 |
| ·SDS-PAGE电泳胶的配制及电泳 | 第86页 |
| ·目的蛋白的Western blot分析 | 第86页 |
| 4 实验结果与分析 | 第86-89页 |
| ·TfpA在酿酒酵母和毕赤酵母中表达比较 | 第86-88页 |
| ·TfpA的在酿酒酵母中的大量表达及浓缩 | 第88页 |
| ·重组TfpA的纯化和Western blot分析 | 第88-89页 |
| 5 讨论 | 第89-92页 |
| 第五章 结论与建议 | 第92-93页 |
| 1 本研究的主要结论 | 第92页 |
| 2 本研究的主要创新点 | 第92页 |
| 3 有待进一步研究的问题 | 第92-93页 |
| 参考文献 | 第93-108页 |
| 附录 | 第108-111页 |
| 致谢 | 第111页 |
