| 致谢 | 第1-4页 |
| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 1 本课题研究的目的和意义 | 第12页 |
| 2 本课题研究的主要内容 | 第12-13页 |
| 3 本课题研究创新点 | 第13-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-25页 |
| ·木聚糖酶 | 第14-15页 |
| ·木聚糖酶的分类 | 第14页 |
| ·木聚糖酶的来源 | 第14-15页 |
| ·木聚糖酶的分子生物学研究进展 | 第15-20页 |
| ·木聚糖酶基因的克隆 | 第15-16页 |
| ·木聚糖酶基因的大肠杆菌中的表达 | 第16-17页 |
| ·木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第17-18页 |
| ·木聚糖酶基因的分子改造 | 第18-20页 |
| ·影响外源蛋白表达因素 | 第20-22页 |
| ·表达载体的影响 | 第20-21页 |
| ·启动子的影响 | 第21页 |
| ·宿主的影响 | 第21页 |
| ·信号肽的影响 | 第21-22页 |
| ·密码子的选择 | 第22页 |
| ·外源基因AT含量 | 第22页 |
| ·mRNA的稳定性 | 第22页 |
| ·外源基因的拷贝数 | 第22页 |
| ·培养条件的影响 | 第22页 |
| ·基于PCR的体外诱变技术 | 第22-24页 |
| ·定点突变 | 第23页 |
| ·随机突变 | 第23页 |
| ·DNA改组 | 第23-24页 |
| ·木聚糖酶的应用研究进展 | 第24-25页 |
| ·在制浆造纸中的应用 | 第24页 |
| ·在饲料工业中的应用 | 第24-25页 |
| 第二章 黑曲霉木聚糖酶基因XYNB的克隆 | 第25-41页 |
| ·实验材料 | 第25-27页 |
| ·菌株及质粒 | 第25页 |
| ·药品与酶 | 第25页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第25-27页 |
| ·主要仪器 | 第27页 |
| ·实验方法 | 第27-35页 |
| ·斜面培养 | 第27页 |
| ·种子摇瓶培养 | 第27页 |
| ·黑曲霉基因组DNA的提取 | 第27-28页 |
| ·引物设计 | 第28页 |
| ·木聚糖酶基因xynB的克隆 | 第28-29页 |
| ·xynB内含子的去除 | 第29-31页 |
| ·琼脂糖凝胶核酸电泳 | 第31页 |
| ·目的片段的回收 | 第31-32页 |
| ·DNA浓缩 | 第32页 |
| ·PCR产物的TA克隆 | 第32页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌 | 第32-33页 |
| ·质粒小量提取 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的PCR验证 | 第34页 |
| ·目的基因的全序列测定 | 第34-35页 |
| ·实验结果与讨论 | 第35-40页 |
| ·黑曲霉基因组DNA提取 | 第35页 |
| ·木聚糖酶基因xynB的PCR扩增及重组质粒的筛选 | 第35-36页 |
| ·xynB基因内含子的分析及去除 | 第36-37页 |
| ·xynB基因序列分析 | 第37-40页 |
| ·小结 | 第40-41页 |
| 第三章 黑曲霉木聚糖酶基因XYNB在大肠杆菌中的表达 | 第41-53页 |
| ·材料与方法 | 第41-43页 |
| ·菌株及质粒 | 第41-42页 |
| ·药品与酶 | 第42页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第42-43页 |
| ·主要仪器 | 第43页 |
| ·实验方法 | 第43-47页 |
| ·引物设计 | 第43页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第43页 |
| ·目的基因的割胶回收 | 第43页 |
| ·目的基因的双酶切 | 第43-44页 |
| ·表达载体pTrc-99a和pET-20b的双酶切 | 第44页 |
| ·目的片段浓缩 | 第44页 |
| ·表达质粒的构建 | 第44页 |
| ·感受态细胞TOP10F’的制备与转化 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第45页 |
| ·重组质粒转化大肠杆菌表达宿主 | 第45页 |
| ·重组木聚糖酶基因xynB的诱导表达 | 第45页 |
| ·重组蛋白的SDS-PAGE分析 | 第45-46页 |
| ·重组木聚糖酶酶活力的测定 | 第46-47页 |
| ·实验结果与讨论 | 第47-52页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第47页 |
| ·原核表达载体的构建及筛选 | 第47-48页 |
| ·重组菌株的诱导表达 | 第48-50页 |
| ·原核表达体系包涵体SDS-PAGE分析 | 第50-52页 |
| ·小结 | 第52-53页 |
| 第四章 黑曲霉木聚糖酶基因XYNB在毕赤酵母中的表达 | 第53-72页 |
| ·材料与方法 | 第53-55页 |
| ·菌株及质粒 | 第53-54页 |
| ·药品与酶 | 第54页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第54-55页 |
| ·主要仪器 | 第55页 |
| ·实验方法 | 第55-61页 |
| ·引物设计 | 第55页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第55-56页 |
| ·PCR扩增产物的割胶回收 | 第56页 |
| ·目的基因的双酶切 | 第56页 |
| ·表达载体pPICzB和pPICZαA的双酶切 | 第56页 |
| ·目的片段浓缩 | 第56页 |
| ·表达质粒的构建 | 第56-57页 |
| ·感受态细胞TOP10F’的制备与转化 | 第57页 |
| ·重组质粒的筛选 | 第57-58页 |
| ·重组质粒的大量提取 | 第58-59页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第59页 |
| ·毕赤酵母超级感受态细胞的制备 | 第59页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第59页 |
| ·重组子甲醇利用型的鉴定 | 第59-60页 |
| ·重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达 | 第60页 |
| ·重组蛋白SDS-PAGE分析 | 第60页 |
| ·重组蛋白Native-PAGE分析 | 第60页 |
| ·重组木聚糖酶酶活力的测定 | 第60页 |
| ·重组木聚糖酶酶学性质的研究 | 第60-61页 |
| ·实验结果与讨论 | 第61-71页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第61-62页 |
| ·真核表达载体的构建和筛选 | 第62页 |
| ·表达载体的线性化 | 第62-63页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第63-64页 |
| ·重组子甲醇利用型的鉴定 | 第64页 |
| ·重组基因工程菌的诱导表达 | 第64-65页 |
| ·重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析 | 第65-66页 |
| ·重组木聚糖酶在不同毕赤酵母中的诱导表达比较 | 第66页 |
| ·不同信号肽序列对重组木聚糖酶诱导表达比较 | 第66-67页 |
| ·重组木聚糖酶酶学性质的研究 | 第67-71页 |
| ·小结 | 第71-72页 |
| 第五章 木聚糖酶基因XYNB的优化及在毕赤酵母中的表达 | 第72-96页 |
| ·材料与方法 | 第72-73页 |
| ·菌株及质粒 | 第72-73页 |
| ·药品与酶 | 第73页 |
| ·培养基及主要试剂配制 | 第73页 |
| ·主要仪器 | 第73页 |
| ·实验方法 | 第73-81页 |
| ·黑曲霉木聚糖酶基因xynB的分析及改造 | 第73-74页 |
| ·全基因合成优化后xynB基因的引物设计 | 第74-75页 |
| ·优化后xynB全基因合成方案 | 第75-76页 |
| ·优化后xynB全基因的获得 | 第76-77页 |
| ·优化后QxynB基因的TA克隆及重组质粒的转化、筛选 | 第77页 |
| ·QxynB基因真核表达载体的构建 | 第77页 |
| ·重组质粒pPICZαA-QxynB电击转化毕赤酵母、表型鉴定及诱导表达 | 第77-78页 |
| ·重组工程菌诱导产酶条件的优化 | 第78页 |
| ·重组工程菌高密度发酵 | 第78-79页 |
| ·Coomassie blue法测定蛋白含量 | 第79-80页 |
| ·木聚糖酶活力的测定及SDS-PAGE分析 | 第80-81页 |
| ·重组木聚糖酶对桦木木聚糖的水解作用 | 第81页 |
| ·实验结果与讨论 | 第81-95页 |
| ·黑曲霉木聚糖酶基因xynB的优化 | 第81-83页 |
| ·黑曲霉木聚糖酶基因xynB的全基因合成 | 第83-84页 |
| ·木聚糖酶基因QxynB真核表达载体的构建及筛选 | 第84-85页 |
| ·重组表达质粒转化毕赤酵母及表型鉴定 | 第85-86页 |
| ·重组菌的筛选及诱导表达 | 第86-87页 |
| ·重组酵母菌的产酶条件优化 | 第87-92页 |
| ·重组酵母菌的高密度发酵 | 第92-93页 |
| ·毕赤酵母高密度发酵产木聚糖酶SDS-PAGE电泳 | 第93-94页 |
| ·重组木聚糖酶对Birchwood xyaln的水解作用 | 第94-95页 |
| ·小结 | 第95-96页 |
| 第六章 重组木聚糖酶最适PH及热稳定性定向进化研究 | 第96-121页 |
| ·实验材料 | 第96-97页 |
| ·菌株及质粒 | 第96页 |
| ·药品与酶 | 第96页 |
| ·培养基与主要试剂的配制 | 第96-97页 |
| ·主要仪器 | 第97页 |
| ·实验方法 | 第97-100页 |
| ·突变引物设计 | 第97-98页 |
| ·定点突变方案 | 第98-100页 |
| ·突变质粒的线性化、电击转化及诱导表达 | 第100页 |
| ·突变木聚糖酶酶学性质的研究 | 第100页 |
| ·实验结果与讨论 | 第100-120页 |
| ·突变位点的确定 | 第100-106页 |
| ·定点突变获得突变基因 | 第106-107页 |
| ·定点突变测序结果分析 | 第107-108页 |
| ·突变质粒转化毕赤酵母及筛选 | 第108-109页 |
| ·突变酶酶学性质的比较与分析 | 第109-120页 |
| ·小结 | 第120-121页 |
| 第七章 结论与展望 | 第121-124页 |
| ·结论 | 第121-122页 |
| ·展望 | 第122-124页 |
| ·进一步提高酶的热稳定性 | 第122页 |
| ·进一步改变的酶最适作用pH | 第122-123页 |
| ·整合酶学性质优良的基因 | 第123页 |
| ·控制重组蛋白的降解机制 | 第123页 |
| ·优化高密度发酵 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-132页 |
| 详细摘要 | 第132-134页 |
| Abstract | 第134-135页 |
