| 缩写词 | 第1-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-42页 |
| 1 研究背景 | 第16-17页 |
| 2 植物体细胞胚胎发生分子生物学研究进展 | 第17-20页 |
| 3 植物体细胞胚胎发生中抗氧化系统代谢动态研究现状 | 第20-21页 |
| 4 植物抗逆性基因克隆策略 | 第21-24页 |
| ·功能克隆 | 第21页 |
| ·定位克隆 | 第21页 |
| ·表型差异克隆 | 第21-22页 |
| ·测序克隆 | 第22页 |
| ·"电子"克隆 | 第22页 |
| ·序列克隆 | 第22-24页 |
| ·植物抗逆基因分离克隆的新技术 | 第24页 |
| 5 植物抗血酸过氧化物酶(APX)分子生物学研究进展 | 第24-35页 |
| ·高等植物中的活性氧清除和抗氧化代谢系统 | 第25-27页 |
| ·APX的同工酶家族及其酶学特性 | 第27-31页 |
| ·APX的同工酶家族 | 第27-30页 |
| ·APX的酶学特性 | 第30-31页 |
| ·抗坏血酸过氧化物酶基因克隆研究 | 第31-33页 |
| ·抗坏血酸过氧化物酶基因表达与逆境胁迫 | 第33-34页 |
| ·抗坏血酸过氧化物酶基因表达与植物体胚发生 | 第34-35页 |
| 6 实时荧光定量PCR技术及其在基因表达定量分析研究中应用 | 第35-38页 |
| ·实时荧光定量PCR技术基本原理 | 第36页 |
| ·实时荧光定量的几种常用方法 | 第36-38页 |
| ·实时荧光定量PCR技术的应用现状 | 第38页 |
| 7 本研究的目的、内容及技术路线 | 第38-42页 |
| ·研究目的及主要内容 | 第38页 |
| ·本研究主要技术路线 | 第38-42页 |
| 第二章 龙眼胚性培养物同步化调控和胁迫处理 | 第42-50页 |
| 第一节 龙眼胚性培养物的同步化调控 | 第42-45页 |
| 1 材料与方法 | 第43页 |
| ·供试材料 | 第43页 |
| ·方法 | 第43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-45页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织的筛选与继代保持 | 第43-44页 |
| ·龙眼胚性培养物同步化材料的获得 | 第44-45页 |
| 3 讨论 | 第45页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织的筛选与长期继代保持的意义 | 第45页 |
| ·龙眼体胚发生同步化材料获得的技术关键 | 第45页 |
| 第二节 龙眼胚性愈伤组织的逆境胁迫处理 | 第45-50页 |
| 1 材料与方法 | 第46-47页 |
| ·供试材料 | 第46页 |
| ·方法 | 第46-47页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织的盐胁迫处理 | 第46页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织的光胁迫处理 | 第46页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织的温度胁迫处理 | 第46-47页 |
| 2 结果与分析 | 第47-48页 |
| ·三种胁迫条件对龙眼胚性愈伤组织生长的影响 | 第47-48页 |
| ·NaCl胁迫对龙眼EC生长的影响 | 第47页 |
| ·光胁迫对龙眼EC生长的影响 | 第47-48页 |
| ·温度胁迫对龙眼EC生长的影响 | 第48页 |
| 3 讨论 | 第48-50页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织是进行逆境处理的理想材料 | 第48-49页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织逆境处理强度需要合理选择 | 第49-50页 |
| 第三章 龙眼胚性愈伤组织胞质型apx基因克隆及原核表达 | 第50-75页 |
| 第一节 龙眼胚性愈伤组织RNA的提取与分离 | 第50-53页 |
| 1 材料与方法 | 第50-51页 |
| ·供试材料 | 第50页 |
| ·试剂 | 第50页 |
| ·龙眼愈伤组织总RNA的提取方法 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-52页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织总RNA提取纯度与浓度检测 | 第51-52页 |
| 3 讨论 | 第52-53页 |
| 第二节 龙眼胞质型apx cDNA全长的获得和序列分析 | 第53-66页 |
| 1 材料和试剂 | 第53-57页 |
| ·供试材料 | 第53页 |
| ·仪器与试剂 | 第53-54页 |
| ·方法 | 第54-57页 |
| ·5′-RACE扩增 | 第54-57页 |
| ·全长序列拼接 | 第57页 |
| ·全长序列分析 | 第57页 |
| 2 结果与分析 | 第57-65页 |
| ·龙眼EC中胞质型apx基因的5′-RACE引物筛选 | 第57-58页 |
| ·龙眼EC中胞质型apx基因5′-RACE特异产物的获得 | 第58-59页 |
| ·龙眼EC中胞质型apx基因全长序列拼接 | 第59-60页 |
| ·龙眼EC中胞质型apx基因序列分析 | 第60-65页 |
| ·核苷酸序列同源性比较 | 第60-62页 |
| ·龙眼cAPX编码基因开放阅读框分析及推导氨基酸序列分析 | 第62-64页 |
| ·龙眼cAPX编码基因内含子分析 | 第64-65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| ·5′ RACE技术的难点及解决方法的探讨 | 第65页 |
| ·龙眼胞质型apx基因cDNA全长获得的意义 | 第65-66页 |
| 第三节 龙眼胞质型apx基因原核表达 | 第66-75页 |
| 1 材料与方法 | 第66-69页 |
| ·供试材料 | 第66页 |
| ·方法 | 第66-69页 |
| ·龙眼胞质型apx基因表达载体的构建 | 第66-68页 |
| ·重组质粒的诱导表达以及SDS-PAGE分析 | 第68页 |
| ·重组质粒的诱导表达产物APX活性的测定 | 第68-69页 |
| 2 结果与分析 | 第69-73页 |
| ·龙眼EC中胞质型apx基因开放阅读框的扩增 | 第69-72页 |
| ·pET29a-APX表达载体构建 | 第72页 |
| ·重组质粒pET29a-APX原核表达分析 | 第72-73页 |
| ·重组质粒PET29a-APX原核表达产物活性测定 | 第73页 |
| 3 讨论 | 第73-75页 |
| ·影响原核表达的主要因素 | 第73-74页 |
| ·龙眼胞质型apx基因原核表达奠定抗逆应用研究的基础 | 第74页 |
| ·龙眼胞质型APX重组蛋白无活性的可能原因 | 第74-75页 |
| 第四章 龙眼胚性培养物APX酶活性测定及同工酶分析 | 第75-94页 |
| 第一节 NaCl、光及温度胁迫处理下龙眼EC中APX活性变化 | 第75-82页 |
| 1 材料与方法 | 第76-77页 |
| ·供试材料 | 第76页 |
| ·方法 | 第76-77页 |
| ·龙眼胚性培养物APX酶活性测定 | 第76-77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-81页 |
| ·龙眼EC继代一个周期中APX活性变化 | 第77页 |
| ·NaCl胁迫下龙眼EC中APX活性变化 | 第77-79页 |
| ·光胁迫下龙眼EC中APX活性变化 | 第79-80页 |
| ·温度迫下龙眼EC的APX活性变化 | 第80-81页 |
| 3 讨论 | 第81-82页 |
| ·龙眼胚性培养物中可能存在多种APX同工酶参与胁迫应答 | 第81-82页 |
| ·龙眼胚性培养物中APX总酶活性变化与胁迫抗性正相关 | 第82页 |
| 第二节 龙眼胚性培养物APX同工酶分析方法的建立 | 第82-86页 |
| 1 材料与方法 | 第82-84页 |
| ·供试材料 | 第82-83页 |
| ·方法 | 第83-84页 |
| ·龙眼胚性培养物APX同工酶的提取 | 第83页 |
| ·APX同工酶垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第83-84页 |
| ·APX同工酶的染色 | 第84页 |
| 2 结果与分析 | 第84-85页 |
| ·不同提取介质对APX同工酶的影响 | 第84页 |
| ·不同电泳缓冲体系对APX同工酶普带的影响 | 第84-85页 |
| ·NBT含量对染色效果影响 | 第85页 |
| 3 讨论 | 第85-86页 |
| 第三节 龙眼体胚发生不同阶段APX同工酶的变化 | 第86-89页 |
| 1 材料与方法 | 第86页 |
| ·供试材料 | 第86页 |
| ·方法 | 第86页 |
| ·龙眼体胚发生不同阶段胚性培养物的APX同工酶电泳 | 第86页 |
| ·同工酶迁移率的计算 | 第86页 |
| 2 结果与分析 | 第86-88页 |
| ·龙眼体胚发生三个典型阶段APX同工酶的变化 | 第86-88页 |
| 3 讨论 | 第88-89页 |
| 第四节 胁迫处理下龙眼EC中APX同工酶变化 | 第89-94页 |
| 1 材料与方法 | 第89页 |
| ·供试材料 | 第89页 |
| ·方法 | 第89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-92页 |
| ·NaCl胁迫下龙眼胚性愈伤组织APX同工酶变化 | 第89-90页 |
| ·光胁迫下龙眼胚性愈伤组织APX同工酶变化 | 第90-91页 |
| ·温度胁迫下龙眼胚性愈伤组织APX同工酶变化 | 第91-92页 |
| 3 讨论 | 第92-94页 |
| ·逆境胁迫对龙眼APX同工酶基因表达的影响 | 第92-93页 |
| ·龙眼APX同工酶基因差异表达与胚性细胞抗逆性紧密联系 | 第93-94页 |
| 第五章 龙眼胚性培养物胞质型apx基因表达实时荧光定量PCR分析 | 第94-110页 |
| 第一节 龙眼胚性愈伤组织中肌动蛋白基因克隆 | 第94-99页 |
| 1 材料和方法 | 第94-95页 |
| ·材料 | 第94页 |
| ·方法 | 第94-95页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织总RNA的提取 | 第94页 |
| ·引物的设计合成 | 第94-95页 |
| ·逆转录和目的基因扩增 | 第95页 |
| ·目的片段的回收、克隆和测序 | 第95页 |
| ·序列拼接和序列生物信息学分析 | 第95页 |
| 2 结果与分析 | 第95-98页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织总RNA的提取结果 | 第95页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织β-actin基因保守区扩增结果 | 第95-96页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织β-actin基因3′端扩增结果 | 第96-97页 |
| ·龙眼胚性愈伤组织β-actin基因片段序列分析 | 第97-98页 |
| 3 讨论 | 第98-99页 |
| 第二节 龙眼体胚发生过程中胞质型apx基因表达分析 | 第99-104页 |
| 1 材料和方法 | 第99-100页 |
| ·材料 | 第99页 |
| ·方法 | 第99-100页 |
| ·总RNA提取和cDNA合成 | 第99页 |
| ·实时荧光定量PCR条件优化和实时定量 | 第99-100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-103页 |
| ·龙眼体胚发生不同阶段培养物总RNA提取 | 第100页 |
| ·荧光实时PCR扩增参照基因和apx基因的参数分析 | 第100-102页 |
| ·龙眼体胚发生过程中apx基因相对定量表达分析 | 第102-103页 |
| 3 讨论 | 第103-104页 |
| ·SYBR Green荧光定量PCR引物设计和扩增效率计算 | 第103-104页 |
| ·胞质型apx在龙眼体胚发生过程中的差异表达 | 第104页 |
| 第三节 温度胁迫下龙眼EC中胞质型apx基因表达的实时荧光定量PCR分析 | 第104-110页 |
| 1 材料和方法 | 第105-106页 |
| ·材料 | 第105页 |
| ·方法 | 第105-106页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第105页 |
| ·总RNA提取和cDNA合成 | 第105页 |
| ·实时荧光定量PCR扩增 | 第105-106页 |
| 2 结果与分析 | 第106-108页 |
| ·不同温度胁迫处理的龙眼EC总RNA提取 | 第106页 |
| ·荧光实时PCR扩增参照基因和apx基因的参数分析 | 第106-107页 |
| ·温度胁迫下龙眼EC中胞质型apx基因的相对表达分析 | 第107-108页 |
| 3 讨论 | 第108-110页 |
| ·SYBR Green实时荧光定量PCR的特点 | 第108页 |
| ·温度诱导龙眼胞质型apx基因表达 | 第108-110页 |
| 第六章 结论 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-121页 |
| 附录1 图版及图版说明 | 第121-125页 |
| 附录2 龙眼胞质型apx基因序列登录GenBank信息 | 第125-127页 |
| 附录3 龙眼β-actin基因序列登录GenBank信息 | 第127-129页 |
| 附录4 龙眼胞质型apx基因拼接序列Blast结果 | 第129-137页 |
| 附录5 龙眼β-actin基因拼接序列Blast结果 | 第137-142页 |
| 附录6 龙眼胞质型apx基因编码产物三级结构预测 | 第142-147页 |
| 在学期间发表论文与参与学术活动情况 | 第147-148页 |
| 致谢 | 第148页 |
