| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-16页 |
| 第一章 前言 | 第16-34页 |
| 1 梨的主要病毒及其危害特点 | 第16-19页 |
| ·苹果花叶病毒(ApMV) | 第16-17页 |
| ·苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV) | 第17-18页 |
| ·苹果茎沟病毒(ASGV) | 第18页 |
| ·苹果茎痘病毒(ASPV) | 第18-19页 |
| 2 ASGV的分子特性 | 第19-21页 |
| ·ASGV的基因组结构 | 第19-20页 |
| ·ASGV的分子变异 | 第20-21页 |
| 3 植物病毒脱除技术途径 | 第21-28页 |
| ·热处理脱除病毒方法 | 第22-23页 |
| ·茎尖培养脱除病毒方法 | 第23-24页 |
| ·化学处理脱除病毒方法 | 第24-26页 |
| ·热处理结合化学处理脱除病毒方法 | 第26页 |
| ·病毒脱除方法在梨上的应用 | 第26-28页 |
| 4 温度对siRNA积累的影响 | 第28-33页 |
| ·siRNA的特点 | 第28-30页 |
| ·热处理脱除病毒机理 | 第30-31页 |
| ·温度对病毒vsiRNA特性的影响 | 第31-33页 |
| 5 研究目的和意义 | 第33-34页 |
| 第二章 梨离体植株继代培养对ASGV群体结构的影响 | 第34-47页 |
| 1 研究材料 | 第34-35页 |
| ·供试植物材料 | 第34页 |
| ·主要试剂 | 第34-35页 |
| 2 研究方法 | 第35-39页 |
| ·样品的收集 | 第35页 |
| ·茎尖的分离培养 | 第35页 |
| ·离体植株样品的收集 | 第35页 |
| ·目标片段的克隆与SSCP分析 | 第35-39页 |
| ·总RNA的提取 | 第35-36页 |
| ·cDNA的合成 | 第36页 |
| ·PCR扩增 | 第36页 |
| ·目标片段的回收 | 第36-37页 |
| ·连接 | 第37页 |
| ·热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第37-38页 |
| ·阳性克隆筛选 | 第38页 |
| ·PCR扩增中rTap DNA聚合酶错配率的计算 | 第38页 |
| ·SSCP | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-45页 |
| ·梨活体植株中ASGV组成的SSCP分析结果 | 第39-40页 |
| ·继代培养中离体植株的病毒检测 | 第40页 |
| ·继代培养中病毒群体的分布特性 | 第40-43页 |
| ·继代培养植株中ASGV变异观察 | 第43-45页 |
| 4 讨论 | 第45-47页 |
| 第三章 ASGV砂梨分离物全基因组序列测定 | 第47-63页 |
| 1 研究材料 | 第47-50页 |
| ·供试植物材料 | 第47页 |
| ·主要试剂 | 第47页 |
| ·所用引物 | 第47-50页 |
| 2 研究方法 | 第50-56页 |
| ·总RNA的提取 | 第50页 |
| ·cDNA的合成 | 第50页 |
| ·PCR扩增 | 第50页 |
| ·3’RACE | 第50-51页 |
| ·反转录 | 第50页 |
| ·巢式PCR扩增 | 第50-51页 |
| ·5’RACE | 第51-55页 |
| ·去磷酸化处理 | 第51-52页 |
| ·“去帽子” | 第52-53页 |
| ·5’RACE Adaptor的连接 | 第53-54页 |
| ·反转录 | 第54页 |
| ·巢式PCR扩增 | 第54-55页 |
| ·目标片段的克隆 | 第55-56页 |
| ·目标片段的回收与纯化 | 第55页 |
| ·连接 | 第55页 |
| ·热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第55页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第55-56页 |
| 3 结果与分析 | 第56-61页 |
| ·ASGV基因组结构 | 第56-57页 |
| ·ASGV全基因组及各阅读框的序列特点 | 第57-61页 |
| 4 讨论 | 第61-63页 |
| 第四章 热处理与化学处理结合脱除梨病毒的研究 | 第63-77页 |
| 1 研究材料 | 第63页 |
| ·待处理材料 | 第63页 |
| ·基本培养基配方 | 第63页 |
| ·主要试剂 | 第63页 |
| 2 研究方法 | 第63-66页 |
| ·供试培养基的配制 | 第63-64页 |
| ·病毒醚母液的配置 | 第63-64页 |
| ·MS培养基的配置 | 第64页 |
| ·含病毒醚的MS培养基的配置 | 第64页 |
| ·离体植株的继代培养 | 第64页 |
| ·脱毒处理方法 | 第64-65页 |
| ·化学处理 | 第64页 |
| ·热处理 | 第64-65页 |
| ·热处理结合化学处理 | 第65页 |
| ·对照的设置 | 第65页 |
| ·培养条件及数据的记录 | 第65页 |
| ·病毒检测 | 第65-66页 |
| ·总RNA的提取 | 第65页 |
| ·cDNA的合成 | 第65-66页 |
| ·PCR扩增 | 第66页 |
| 3 结果与分析 | 第66-75页 |
| ·不同处理对梨离体植株生长表型的影响 | 第66-68页 |
| ·不同处理对梨离体植株株高和增殖的影响 | 第68-70页 |
| ·不同处理的脱毒效果 | 第70-75页 |
| 4 讨论 | 第75-77页 |
| 第五章 热处理植株中ASGV产生的小分子RNAS鉴定 | 第77-93页 |
| 1 研究材料 | 第77-78页 |
| ·供试植物材料 | 第77页 |
| ·主要试剂 | 第77-78页 |
| ·所用引物 | 第78页 |
| 2 研究方法 | 第78-82页 |
| ·总RNA的提取 | 第78-79页 |
| ·Dnase的消化 | 第79页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第79-80页 |
| ·Real-Time RT-PCR扩增 | 第80-81页 |
| ·病毒产生的siRNA的Real-Time RT-PCR扩增 | 第80-81页 |
| ·病毒的Real-Time RT-PCR扩增 | 第81页 |
| ·离体植株材料的获得 | 第81-82页 |
| ·离体植株的培养 | 第81页 |
| ·材料的收集 | 第81-82页 |
| ·离体植株的热处理 | 第82页 |
| ·热处理材料中siRNA的高通量测序 | 第82页 |
| 3 结果与分析 | 第82-90页 |
| ·离体植株不同部位的病毒含量 | 第82-83页 |
| ·热处理不同时期病毒含量的变化 | 第83页 |
| ·测序样品的总RNA质量检测 | 第83-85页 |
| ·总RNA的琼脂糖凝胶电泳分析 | 第83-84页 |
| ·样品总RNA的Agilent 2100检测 | 第84-85页 |
| ·热处理样品中ASGV产生的siRNA的特性 | 第85-88页 |
| ·vsiRNA的数量 | 第85页 |
| ·vsiRNA的片段大小及偏向性 | 第85-86页 |
| ·vsiRNA出现的频率及在基因组上的分布 | 第86-88页 |
| ·热处理不同时期ASGV与其siRNA的含量变化 | 第88-90页 |
| ·热处理不同时期离体材料中ASGV的含量变化 | 第88页 |
| ·热处理不同时期ASGV产生的siRNA的含量变化 | 第88-90页 |
| 4 讨论 | 第90-93页 |
| 参考文献 | 第93-111页 |
| 附录A 常用溶液配方 | 第111-113页 |
| 附录B ASGV-HH全基因组序列 | 第113-117页 |
| 附录C 研究生期间发表文章 | 第117-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
