| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 G蛋白偶联受体研究进展 | 第11-36页 |
| 1.G蛋白偶联受体及其应用 | 第11-20页 |
| ·G蛋白偶联受体的结构和功能特点 | 第11-13页 |
| ·G蛋白偶联受体的分类 | 第13-15页 |
| ·G蛋白偶联受体配体结合域 | 第15-17页 |
| ·G蛋白偶联受体的生物信息数据库 | 第17页 |
| ·孤儿G蛋白偶联受体及其配基发现 | 第17-19页 |
| ·G蛋白偶联受体与药物研究 | 第19-20页 |
| 2.G蛋白偶联受体的异源表达 | 第20-28页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第20-21页 |
| ·杆状病毒/昆虫细胞表达系统 | 第21页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统 | 第21-22页 |
| ·酵母表达系统 | 第22-28页 |
| 参考文献 | 第28-36页 |
| 第二章 人缓激肽受体(B2 receptor)的克隆、酵母表达和功能研究 | 第36-73页 |
| 前言 | 第36-39页 |
| 一.材料 | 第39-42页 |
| 1.菌株和质粒 | 第39页 |
| 2.实验试剂 | 第39-42页 |
| 3.主要仪器设备 | 第42页 |
| 二.方法 | 第42-55页 |
| 1.人脐静脉内皮细胞的培养 | 第42-43页 |
| 2.内皮细胞总RNA的抽提 | 第43-44页 |
| 3.PCR引物的设计 | 第44页 |
| 4.逆转录和PCR(RT-PCR)及PCR产物回收纯化 | 第44-46页 |
| 5.PCR产物的T-A克隆 | 第46页 |
| 6.大肠杆菌感受态细胞的制备及热击转化 | 第46-47页 |
| 7.转化子的验证 | 第47-49页 |
| 8.EGFP融合的缓激肽受体的酵母表达载体(pPIC9K-B2R-EGFP)的构建 | 第49页 |
| 9.酵母(GS115)感受态细胞的制备和pPIC9K-B2-EGFP的电击转化 | 第49-50页 |
| 10.pPIC9K-B2R-EGFP转化子的挑选和鉴定 | 第50-51页 |
| 11.多拷贝整合转化子的筛选 | 第51页 |
| 12.pPIC9K-B2-EGFP转化子的诱导培养 | 第51页 |
| 13.流式细胞仪检测 | 第51页 |
| 14.激光共聚焦荧光观察 | 第51-52页 |
| 15.western印迹分析 | 第52-54页 |
| 16.免疫荧光分析 | 第54-55页 |
| 17.功能验证—配体受体结合的免疫荧光分析 | 第55页 |
| 三.结果与讨论 | 第55-66页 |
| 1.人脐静脉内皮细胞总RNA的抽提 | 第55-56页 |
| 2.缓激肽受体2(Bradykinin receptor 2,B_2R)基因的克隆 | 第56页 |
| 3.EGFP融合的pPIC9K-B_2R-EGFP的构建 | 第56-58页 |
| 4.PIC9K-B2R-EGFP转化子(His~+Mut~+)的挑选和鉴定及多拷贝基因的筛选 | 第58-59页 |
| 5.流式细胞仪检测 | 第59-60页 |
| 6.激光共聚焦荧光观察 | 第60-62页 |
| 7.B_2R-EGFP融合蛋白的Western印迹分析 | 第62-63页 |
| 8.免疫荧光分析 | 第63-65页 |
| 9.配体受体结合的免疫荧光分析 | 第65-66页 |
| 四.结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 第三章 人内皮细胞分化因子受体1的克隆、酵母表达和功能鉴定 | 第73-104页 |
| 前言 | 第73-75页 |
| 一.材料 | 第75页 |
| 1.细胞、菌株、质粒 | 第75页 |
| 2.实验试剂 | 第75页 |
| 3.主要仪器设备 | 第75页 |
| 二.方法 | 第75-82页 |
| 1.PCR引物的设计、逆转录和PCR(RT-PCR) | 第75-76页 |
| 2.PCR产物的T-A克隆、大肠杆菌热击转化及转化子的验证 | 第76页 |
| 3.EGFP融合的内皮细胞分化因予受体1受体的酵母表达载体(pPIC9K-edg-EGFP)的构建 | 第76-77页 |
| 4.pPIC9K-edg-1-EGFP的电击转化 | 第77页 |
| 5.pPIC9K-edg-1-EGFP的转化子的挑选和鉴定 | 第77页 |
| 6.pPIC9K-edg-1-EGFP转化子的诱导培养 | 第77页 |
| 7.流式细胞仪的筛选 | 第77页 |
| 8.激光共聚焦荧光观察 | 第77页 |
| 9.Western印迹分析 | 第77-78页 |
| 10.免疫荧光分析 | 第78页 |
| 11.配体受体结合分析 | 第78-82页 |
| ·SPHK的克隆和原核表达 | 第78-81页 |
| ·S-1-~(32)P的制备 | 第81页 |
| ·细胞膜的制备 | 第81-82页 |
| ·发配体受体结合分析 | 第82页 |
| 12.S1P对重组酵母细胞生长的影响 | 第82页 |
| 三.结果和讨论 | 第82-97页 |
| 1.内皮细胞分化因子受体1(edg-1)基因的克隆 | 第82-83页 |
| 2.EGFP融合的pPIC9K-edg-1-EGFP的构建 | 第83-84页 |
| 3.pPIC9K-edg-1-EGFP的电击转化和转化子的诱导培养 | 第84-85页 |
| 4.流式细胞仪检测 | 第85-86页 |
| 5.激光共聚焦荧光观察 | 第86-90页 |
| 6.edg-1-EGFP融合蛋白的Western印迹分析 | 第90-91页 |
| 7.免疫荧光分析 | 第91-93页 |
| 8.受体配体的结合分析 | 第93-96页 |
| ·SPHK的克隆和原核表达 | 第93-95页 |
| ·S-1-~(32)P的制备 | 第95-96页 |
| ·配体受体结合分析 | 第96页 |
| 9.S1P对重组酵母细胞生长的影响 | 第96-97页 |
| 四.结论 | 第97-99页 |
| 参考文献 | 第99-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
