| 中文摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 英文缩略词表 | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-53页 |
| 1. 黄酮类化合物研究现状 | 第14-25页 |
| 1.1 黄酮类化合物的结构和功能 | 第14-17页 |
| 1.2 黄酮类化合物的生物合成途径 | 第17-24页 |
| 1.2.1 总的苯丙烷代谢途径(GPP) | 第18-19页 |
| 1.2.2 黄酮特异分支途径 | 第19-22页 |
| 1.2.3 黄酮的糖苷化修饰以及UGT | 第22-24页 |
| 1.3 MYB转录因子对黄酮类生物合成的调控 | 第24-25页 |
| 2 植物miRNA的研究现状 | 第25-31页 |
| 2.1 植物miRNA的产生机制和作用方式 | 第25-26页 |
| 2.2 植物miRNA对MYB转录因子的调控 | 第26-31页 |
| 2.2.1 多种miRNA靶向调控MYB | 第26-27页 |
| 2.2.2 miR828对MYB的调控及其生物学功能 | 第27-31页 |
| 2.2.2.1 miR828-MYB cascade调控方式 | 第29页 |
| 2.2.2.2 miR828-ta-siRNA-MYB cascade的调控功能 | 第29-31页 |
| 3 植物中的ta-siRNA | 第31-33页 |
| 4 丹参的生物活性成分研究现状 | 第33-38页 |
| 4.1 丹参研究概述 | 第33-34页 |
| 4.2 丹参酮类化合物的生物合成 | 第34-35页 |
| 4.3 丹参酚酸类化合物的生物合成 | 第35-37页 |
| 4.4 MYB转录因子对丹参次生代谢物合成的调控 | 第37-38页 |
| 5 研究意义与研究内容 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-53页 |
| 第二章 丹参黄酮生物合成途径酶基因的鉴定和分析 | 第53-101页 |
| 1 所用试剂与仪器 | 第53-54页 |
| 1.1 主要试剂 | 第53-54页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第54页 |
| 2 实验方法 | 第54-64页 |
| 2.1 基于丹参全基因组鉴定黄酮生物合成相关的基因 | 第54-55页 |
| 2.2 基因特异性引物的设计与合成 | 第55-57页 |
| 2.3 植物RNA的提取与检测 | 第57-58页 |
| 2.3.1 植物材料 | 第57页 |
| 2.3.2 植物总RNA提取 | 第57页 |
| 2.3.3 植物总RNA中植物基因组DNA的去除、纯化 | 第57-58页 |
| 2.3.4 RNA的检测 | 第58页 |
| 2.4 cDNA的合成 | 第58-59页 |
| 2.5 丹参黄酮生物合成途径基因的克隆 | 第59-61页 |
| 2.5.1 黄酮生物合成途径基因全长CDS的克隆 | 第59页 |
| 2.5.2 DNA条带琼脂糖凝胶回收 | 第59-60页 |
| 2.5.3 目的基因片段与T载体连接 | 第60页 |
| 2.5.4 转化大肠杆菌 | 第60页 |
| 2.5.5 PCR鉴定阳性克隆和测序 | 第60-61页 |
| 2.6 实时定量PCR | 第61-64页 |
| 2.6.1 实时定量PCR用cDNA模板的合成 | 第61页 |
| 2.6.2 实时定量PCR用反应体系和反应条件 | 第61-64页 |
| 2.7 生物信息学分析 | 第64页 |
| 3 实验结果与分析 | 第64-93页 |
| 3.1 丹参中黄酮生物合成相关酶基因的预测和分子克隆 | 第64-66页 |
| 3.2 丹参SmCHS基因的鉴定和分析 | 第66-71页 |
| 3.3 丹参SmCHI基因的鉴定和分析 | 第71-74页 |
| 3.4 丹参SmFNSII SmF3'5'H和SmF3'H的鉴定和分析 | 第74-82页 |
| 3.5 丹参SmF3H、SmFLS和SmANS的鉴定和分析 | 第82-87页 |
| 3.6 丹参SmDFR的鉴定和分析 | 第87-90页 |
| 3.7 黄酮生物合成相关基因对外源MeJA处理的响应 | 第90-93页 |
| 4 讨论和小结 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-101页 |
| 第三章 丹参全基因组范围内鉴定、分析UGT | 第101-124页 |
| 1 材料和方法 | 第101-103页 |
| 1.1 丹参全基因组范围内鉴定SmUGT | 第101页 |
| 1.2 SmUGTs的生物信息学分析 | 第101-103页 |
| 1.3 应用转录组数据分析SmUGT的表达 | 第103页 |
| 2 实验结果与分析 | 第103-120页 |
| 2.1 丹参中SmUGT基因的鉴定 | 第103-108页 |
| 2.2 进化分析与比较 | 第108-113页 |
| 2.3 GO功能注释 | 第113-115页 |
| 2.4 丹参转录组数据分析 | 第115-120页 |
| 2.4.1 SmUGT的组织特异性表达 | 第115-118页 |
| 2.4.2 SmUGT与黄酮生物合成途径结构酶基因的共表达 | 第118-120页 |
| 3 讨论和小结 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-124页 |
| 第四章 丹参miR828靶基因的系统分析 | 第124-147页 |
| 1 所用试剂与仪器 | 第124-125页 |
| 1.1 主要试剂与酶 | 第124页 |
| 1.2 主要仪器设备 | 第124-125页 |
| 2 实验材料与方法 | 第125-129页 |
| 2.1 靶基因的生物信息学预测 | 第125-126页 |
| 2.2 MYB类靶基因的克隆 | 第126-127页 |
| 2.2.1 植物RNA的提取与检测 | 第126页 |
| 2.2.1.1 植物材料 | 第126页 |
| 2.2.1.2 植物总RNA提取 | 第126页 |
| 2.2.1.3 植物总RNA中植物基因组DNA的去除以及纯化 | 第126页 |
| 2.2.1.4 RNA的定量与完整性检测 | 第126页 |
| 2.2.2 cDNA第一链的合成 | 第126页 |
| 2.2.3 PCR克隆MYB类靶基因 | 第126-127页 |
| 2.3 克隆得到MYB序列的生物信息学分析 | 第127页 |
| 2.4 靶基因的实时荧光定量PCR | 第127-128页 |
| 2.5 候选靶基因的RLM-5'RACE实验验证 | 第128-129页 |
| 3 实验结果与分析 | 第129-141页 |
| 3.1 生物信息学方法鉴定miR828和TAS4-siR81(-)的靶基因 | 第129-139页 |
| 3.1.1 miR828靶基因的鉴定 | 第130页 |
| 3.1.2 miR828切割SmTAS4与SmMYB111介导产生phased-siRNA | 第130-133页 |
| 3.1.3 MYB类靶基因的序列特征 | 第133页 |
| 3.1.4 MYB进化关系分析 | 第133-135页 |
| 3.1.5 MYB序列比对分析 | 第135-138页 |
| 3.1.6 MYB类靶基因与黄酮生物合成途径基因的共表达分析 | 第138-139页 |
| 3.2 miR828和Sm-TAS4-siR81(-)靶基因的组织特异性表达 | 第139-140页 |
| 3.3 靶基因的RLM-5'RACE验证 | 第140-141页 |
| 4. 讨论和小结 | 第141-144页 |
| 参考文献 | 第144-147页 |
| 第五章 丹参miR828的转基因植株分析 | 第147-195页 |
| 1 实验试剂与仪器 | 第147-149页 |
| 1.1 实验试剂及药品 | 第147-148页 |
| 1.2 实验仪器 | 第148-149页 |
| 2 实验材料与方法 | 第149-161页 |
| 2.1 丹参miR828过表达载体的构建 | 第149-151页 |
| 2.1.1 目的基因质粒和载体质粒双酶切 | 第149页 |
| 2.1.2 酶切产物跑电泳、切胶回收 | 第149页 |
| 2.1.3 连接反应 | 第149页 |
| 2.1.4 连接产物转化大肠杆菌 | 第149-150页 |
| 2.1.5 连接产物的验证 | 第150-151页 |
| 2.2 丹参miR828过表达载体转入农杆菌GV3101 | 第151页 |
| 2.3 MIR828对丹参的遗传转化 | 第151-152页 |
| 2.4 转基因丹参植株的鉴定 | 第152-155页 |
| 2.4.1 转基因丹参植株的PCR鉴定 | 第152-153页 |
| 2.4.1.1 转基因丹参植株的DNA提取 | 第152-153页 |
| 2.4.1.2 转基因丹参植株的PCR鉴定 | 第153页 |
| 2.4.2 转基因丹参植株的表达鉴定 | 第153-155页 |
| 2.4.2.1 提取转基因丹参含有miRNA的total RNA | 第153-154页 |
| 2.4.2.2 转基因丹参植株miR828成熟体的表达分析 | 第154-155页 |
| 2.5 转基因丹参植株的化学分析 | 第155-158页 |
| 2.5.1 植物材料 | 第155页 |
| 2.5.2 花青素含量的测定 | 第155页 |
| 2.5.3 总酚含量的测定 | 第155-156页 |
| 2.5.3.1 制作没食子酸标准曲线 | 第155-156页 |
| 2.5.3.2 丹参总酚含量的测定 | 第156页 |
| 2.5.4 丹参总黄酮含量的测定 | 第156-157页 |
| 2.5.4.1 制作表儿茶素标准曲线 | 第156-157页 |
| 2.5.4.2 丹参中总黄酮含量的测定 | 第157页 |
| 2.5.5 丹参代谢组的检测和分析 | 第157-158页 |
| 2.5.5.1 样品提取流程 | 第157页 |
| 2.5.5.2 液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析 | 第157-158页 |
| 2.5.5.3 代谢物的定性与定量 | 第158页 |
| 2.6 转基因丹参植株的RNA-seq测序和分析 | 第158-160页 |
| 2.6.1 植物材料的准备 | 第158页 |
| 2.6.2 RNA-seq测序 | 第158-159页 |
| 2.6.3 转录组的生物信息学分析 | 第159-160页 |
| 2.7 转基因植株的实时荧光定量PCR检测 | 第160-161页 |
| 3 实验结果与分析 | 第161-188页 |
| 3.1 丹参pGPTV-hpt-MIR828载体的获得 | 第161-163页 |
| 3.2 pGPTV-hpt-MIR828转化农杆菌 | 第163页 |
| 3.3 丹参遗传转化,获得转基因植株 | 第163-166页 |
| 3.4 转基因丹参植株的化学分析 | 第166-180页 |
| 3.4.1 转基因丹参中花青素含量 | 第166页 |
| 3.4.2 转基因丹参中总酚含量 | 第166-167页 |
| 3.4.3 丹参中总黄酮含量 | 第167-168页 |
| 3.4.4 丹参代谢组分析 | 第168-180页 |
| 3.5 转基因与野生型丹参根和叶片的转录组分析 | 第180-187页 |
| 3.5.1 mRNA差异表达分析 | 第180-181页 |
| 3.5.2 丹参次生代谢相关基因的转录组分析 | 第181-186页 |
| 3.5.3 丹参miR828前体以及其靶基因在转录组中的分析 | 第186-187页 |
| 3.6 转基因与野生型丹参根和叶片的RT-PCR分析 | 第187-188页 |
| 4 讨论和小结 | 第188-192页 |
| 4.1 miR828在丹参根次生代谢物合成中的生物学功能 | 第188-190页 |
| 4.2 miR828在丹参叶次生代谢物合成中的生物学功能 | 第190-192页 |
| 参考文献 | 第192-195页 |
| 第六章 结论与展望 | 第195-198页 |
| 1. 结论 | 第195-196页 |
| 2. 展望 | 第196-198页 |
| 致谢 | 第198-199页 |
| 作者简介 | 第199-200页 |
| 附录 | 第200-222页 |
